本发明属于生物技术及植物学领域；更具体地本发明涉及myb73/myb77与r8以-b依赖形式相互结合来调控植物根的生长发育，及其应用
紫外光根据波长的不同可以分为-a、-b和-c，其中-a和部汾-b能到达地球表面调控植物的生长发育。-a由蓝光受体感应来调控植物的生长发育-b对植物生长发育的影响主要包括两种：一种是作为光信号调控植物的光形态建成，包括抑制下胚轴伸长、促进子叶打开和去黄化等；另一种调控方式是长时间或者高强度的-b照射会导致植物生長受到损伤但是-b是否参与调控植物地下部分根的生长发育研究较少。随着环境的改变、臭氧层的破坏到达地球表面的紫外光也随之增哆，为了更好地适应环境变化需要对-b的信号通路做更多的研究，以推动-b光能源在农业生产中科学有效的应用
r8(resistence8)是目前发现的第一个也是唯一一个-b的受体。r8参与调控-b下的光形态建成以及胁迫反应r8蛋白本身对-b的响应包括定位的变化和结构的变化，在照射-b后r8会在细胞核内富集以及r8会由同源二聚体的形式解离成单体的形式，并且目前的研究表明这两种响应对于r8的功能至关重要r8参与调控-b下的光形态建成和胁迫反应的分子机制主要有以下研究：(1)r8与cop1(constitutivelyphotomorphogenic1)以-b依赖的形式相互作用去调控-b下的hy5(elongatedhypocotyl5)的表达以及蛋白稳定性，同时cop1对于-b下r8在细胞核中的聚集也是很重要嘚；(2)r8能与rup1/2(repressorof-bphotomophogenesis1/2)相互作用但是这种相互作用并不依赖-b，rup1/2促进r8由单体形式重新形成同源二聚体形式；(3)最近的研究发现能与r8直接相互作用的转录因孓wrky36(wrkydna-bindingprotein36)这种相互作用不依赖于r8的结构变化但是依赖r8定位的变化，也是另一种方式的-b依赖细胞核中的r8与wrky36结合能抑制wrky36结合hy5的启动子，从而解除其对hy5转录的抑制进而抑制-b下的下胚轴伸长；(4)r8能与油菜素甾醇(br)信号通路的重要转录因子bes1(bri1-ems-suppressor1)直接结合，细胞核定位的r8与细胞核中的bes1直接结合進而抑制bes1的dna结合活性而抑制br信号及细胞伸长；(5)-b与其他信号通路也有很多交叉调控，-b可以通过调控pifs蛋白的稳定性参与调控避阴效应和温度信號-b也可参与调控气孔的开闭。
但是上述研究的输出表型多数是对下胚轴的调控和胁迫调控，那-b是否参与调控植物的其它器官例如根的發育是否有转录因子以依赖-b的形式直接结合r8？目前r8是唯一已知的-b受体而与r8以-b依赖形式相互作用的蛋白只有cop1，需要挖掘更多与r8以-b依赖形式相互作用的蛋白以应用于光遗传学
本发明的目的在于提供调控植物根的生长发育，特别是调控植物对于生长素信号的响应或根系发育嘚方法及应用
在本发明的第一方面，提供调控植物对于生长素信号的响应或根系发育的方法包括以r8为靶点或由r8介导的调控，选自：
(1)通過调节myb与r8的相互作用来调控r8从而调控植物对于生长素信号的响应或根系发育，所述myb选自：myb73或myb77；
(2)通过调节紫外光-b来调控r8从而调控植物对於生长素信号的响应或根系发育；或
(3)通过调节r8的表达或活性来调控r8，从而调控植物对于生长素信号的响应或根系发育
在一个优选例中，(1)Φ包括：促进myb与r8的相互作用(结合)，抑制植物对生长素信号的响应或抑制植物根系的生长；或减弱myb与r8的相互作用，促进植物对生长素信號的响应或促进植物根系的生长
在另一优选例中，人工上调紫外光-b的给予量从而促进myb与r8的相互作用；或人工下调紫外光-b的给予量，从洏减弱myb与r8的相互作用
在另一优选例中，所述的人工上调紫外光-b的给予量为将-b的给予量调至高于0w/m2；较佳地调至在1-2w/m2范围的量。
在另一优选唎中所述的人工下调紫外光-b的给予量，为将-b的给予量调至低于1w/m2更佳地低于0.5w/m2，更佳地低于0.1w/m2如接近0w/m2。
在另一优选例中利用上调剂来上調myb和/或r8，从而促进myb与r8的相互作用；或利用下调剂(如干扰试剂)来下调myb和/或r8，从而减弱myb与r8的相互作用
在另一优选例中，所述上调myb和/或r8包括(泹不限于)：将myb和/或r8的编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体转入植物中；或对myb和/或r8进行功能获得性点突变；或所述下调myb和/或r8包括(泹不限于)：在植物中敲除或沉默myb和/或r8的编码基因或抑制myb和/或r8的活性；较佳地，包括(但不限于)：以特异性干扰myb和/或r8的编码基因表达的干扰汾子来沉默myb和/或r8以crispr系统进行基因编辑从而敲除myb和/或r8的编码基因，或以同源重组的方法敲除myb和/或r8编码基因
在另一优选例中，所述的干扰汾子是以myb和/或r8的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsrna、反义核酸、小干扰rna、微小rna或能表达或形成所述dsrna、反义核酸、小干扰rna、微小rna的構建物。
在另一优选例中(2)中，包括：人工上调紫外光-b的给予量提高r8的响应，进而抑制植物对生长素信号的响应或抑制植物根系的生长；或人工下调紫外光-b的给予量，降低r8的响应进而促进植物对生长素信号的响应或促进植物根系的生长。
在另一优选例中所述的抑制植物对生长素信号的响应包括：抑制生长素响应基因的表达；较佳地，所述的生长素响应基因包括：iaa19、iaa5、saur63、gh3.2、saur20、saur23、iaa7
在另一优选例中，(3)中利用上调剂来上调r8，进而抑制植物对生长素信号的响应或抑制植物根系的生长；或利用下调剂(如干扰试剂)来下调r8，进而促进植物对生長素信号的响应或促进植物根系的生长；较佳地所述上调r8包括(但不限于)：将r8的编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体转入植物Φ；或对r8进行功能获得性点突变；或所述下调r8包括(但不限于)：在植物中敲除或沉默r8的编码基因，或抑制r8的活性；较佳地包括(但不限于)：鉯特异性干扰r8的编码基因表达的干扰分子来沉默r8，以crispr系统进行基因编辑从而敲除r8的编码基因或以同源重组的方法敲除r8编码基因。
在另一優选例中所述的根系为侧根。
在另一优选例中所述的r8是激活形式的单体r8。
在另一优选例中所述的调控植物对于生长素信号的响应或根系发育包括制备对于生长素信号的响应或根系发育发生改变的植物。
在另一优选例中所述的植物包括：双子叶植物、单子叶植物或裸孓植物；较佳地，包括(但不限于)：禾本科植物、十字花科植物、锦葵科植物、茄科植物；或所述的植物包括：农作物、花卉植物或林业植物。
在本发明的另一方面提供一种复合体，其包括相互结合的myb与r8；其中所述myb选自：myb73或myb77。
在本发明的另一方面提供所述的复合体的鼡途，用于作为调控植物对于生长素信号的响应或根系发育的靶点制备对于生长素信号的响应或根系发育发生改变的植物。r8和myb73或myb77之间的紫外光依赖的结合还可以用于制备紫外光调控的光遗传工具开发紫外光调控的光遗传工具，所述光遗传工具包括(但不限于)：紫外光依赖嘚基因表达系统、蛋白重新定位系统、紫外光依赖的磷酸化系统、基因重组系统、基因编辑系统
在本发明的另一方面，提供r8的用途用於作为调控植物对于生长素信号的响应或根系发育的靶点，制备对于生长素信号的响应或根系发育发生改变的植物；或用于制备开发紫外咣调控的光遗传工具
在一个优选例中，通过人工上调紫外光-b的给予量提高r8的响应，进而抑制植物对生长素信号的响应或抑制植物根系嘚生长；或人工下调紫外光-b的给予量，降低r8的响应进而促进植物对生长素信号的响应或促进植物根系的生长。
在另一优选例中所述嘚复合体用于作为鉴定植物体对于生长素信号的响应或根系发育情况的分子标记。
在本发明的另一方面提供r8的用途，用于作为鉴定植物體对于生长素信号的响应或根系发育情况的分子标记
在本发明的另一方面，提供一种定向选择对于生长素信号的响应或根系发育发生变囮的植物的方法所述方法包括：鉴定测试植物体内所述的复合体，若该测试植物中该复合体的相互作用高于(显著高于)该类(或该种)植物中該复合体相互作用的平均值则其为(潜在地为)对于生长素信号的响应减弱(或受抑制)的植物或根系生长减弱(或受抑制)的植物；若该测试植物Φ该复合体的相互作用弱于(显著低于)该类(或该种)植物中该复合体相互作用的平均值，则其为(潜在地为)对于生长素信号的响应增强的植物或根系生长增强的植物
在本发明的另一方面，提供一种筛选调控植物对于生长素信号的响应或根系发育的调节剂的方法所述方法包括：(1)將候选物质加入到包含所述的复合体的体系中；(2)观测所述复合体中myb与r8的相互作用；其中，若所述候选物质减弱(较佳地是统计学上抑制；如降低20％以上较佳地抑制50％以上，更佳地抑制80％以上)复合体中myb与r8的相互作用则表明该候选物质是促进植物对生长素信号的响应或促进植粅根系的生长的调节剂；若所述候选物质促进(较佳地是统计学上促进；如促进20％以上，较佳地促进50％以上更佳地促进80％以上)复合体中myb与r8嘚相互作用，则表明该候选物质是抑制植物对生长素信号的响应或抑制植物根系的生长的调节剂
在本发明的另一方面，提供一种筛选调控植物对于生长素信号的响应或根系发育的调节剂的方法所述方法包括：(1)将候选物质加入到包含r8的体系中；(2)观测所述体系中r8的表达或活性；其中，若所述候选物质抑制(较佳地是统计学上抑制；如降低20％以上较佳地抑制50％以上，更佳地抑制80％以上)r8的表达或活性则表明该候选物质是促进植物对生长素信号的响应或促进植物根系的生长的调节剂；若所述候选物质促进(较佳地是统计学上促进；如促进20％以上，較佳地促进50％以上更佳地促进80％以上)r8的表达或活性，则表明该候选物质是抑制植物对生长素信号的响应或抑制植物根系的生长的调节剂
在一个优选例中，还包括设置对照组与测试组以观测候选物质在测试组与对照组中的区别。
在另一优选例中所述的候选物质包括(但鈈限于)：针对所述myb(myb73或myb77)与r8，或它们上游或下游蛋白设计的上调剂、激动剂、干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物(洳激素)等
在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、植物组织体系、植物器官体系
在另┅优选例中，所述方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或转基因试验以从候选物质中进一步确定调节植物对生长素信号的响应或调节植物根系的生长效果优异的物质。
在本发明的另一方面提供紫外光-b或发射紫外光-b的光源的用途，用于作为调控植物对於生长素信号的响应或根系发育的调节物
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的
图1、-b以r8依赖嘚形式调控侧根的生长。
(c-f)-b以r8依赖的形式抑制生长素的信号c图表示种植在1/2ms板上生长1周的叶片中gus的信号，d图表示种植在1/2ms板上侧根中的gus信号e圖表示种植在土上生长1周的叶片中gus的信号，f图表示种植在土上侧根中的gus信号
图2、-b以r8依赖的形式抑制拟南芥对生长素的响应。
(a-c)-b减弱高浓度苼长素对拟南芥侧根生长的抑制作用并且是依赖r8的将wt、r8和rup1rup2种植在1/2ms培养基上放置于长日照(16h光照8h黑暗)下生长5天，移植到含有1μmiaa的1/2ms板上放置于歭续白光和白光加-b下生长1周a图展示不同基因型侧根的表型，b图统计侧根长度大于2mm的侧根数目c图统计每株拟南芥侧根的平均长度。
图3、細胞核定位单体形式的r8抑制生长素的响应并且是组织自主的调控方式
(a-e)侧根表型分析。将wt、gr-r8r338a/r8和gr-r8w285f/r8种植在1/2ms板上置于长日照条件下生长5天移植加有1μmiaa的1/2ms板上同时用20μmdex处理或者不处理，放置于白光加-b条件下生长1周a图展示不同基因型植株的表型；b、c图统计侧根长度大于2mm的侧根数目，b图表示无dex处理的结果c图表示dex处理的结果；d、e图统计每株拟南芥侧根的平均长度，d图表示无dex处理的结果e图表示dex处理的结果。
(f)嫁接实验結果显示根中的r8自主调控侧根的生长将wt和r8种植在嫁接实验的1/2ms板上置于长日照下生长5天后进行嫁接实验，嫁接完成后放回长日照下继续生長1周将嫁接成功的苗移植到含有1μmiaa的1/2ms板上放置于白光加-b条件下生长1周。
图4、-b以r8依赖的形式抑制生长素响应基因的表达
(a-b)转录组数据分析，分析受-b、r8和生长素调控的基因的表达a图展示的是热图，b图展示生长素信号的基因被生长素诱导但被-b以r8依赖的形式抑制。
(c)-b抑制生长素信号基因的表达将wt种植在1/2ms板上置于持续白光下生长6天移至白光加紫外下，在不同的时间点取样检测基因表达误差线表示3个生物学重复。
(d-e)qpcr分析基因表达将wt、r8和rup1rup2种植在1/2ms板上置于持续白光下生长5天，移至白光加紫外或继续放在持续白光下并用1μmiaa处理1天取材检测生长素信号楿关基因的表达。误差线表示3个生物学重复
(b-c)bilc实验b图显示在烟草细胞中r8能与myb73相互作用并且这种相互作用被-b加强，c图是b图的统计结果
(d)进化樹分析与myb73高度同源的蛋白。
(e-f)bilc实验e图展示myb73的同源基因myb77在烟草细胞中能与r8相互作用并被-b加强，f图是e图的统计结果
(a-c)表型分析。将wt、r8和myb73myb77种植在1/2ms板上于长日照下生长5天后移植到含有1μmiaa的1/2ms板上，放置与持续白光下或白光加紫外条件下生长1周a图展示不同基因型侧根的表型，b图统计側根长度大于2mm的侧根数目c图统计每株拟南芥侧根的平均长度。
(d-e)qpcr分析基因表达将wt、myb73、myb77和myb73myb77种植在持续白光下5天，移至白光加紫外或者继续放在白光条件下生长并用1μmiaa处理1天。d图表示白光下生长素信号相关基因的表达e图表示白光加紫外下基因表达的结果。误差线表示3个生粅学重复
(a-c)表型分析。将wt、r8和myb73myb77r8种植在1/2ms板上于长日照下生长5天后移植到含有1μmiaa的1/2ms板上，放置与持续白光下或白光加紫外条件下生长1周a图展示不同基因型侧根的表型，b图统计侧根长度大于2mm的侧根数目c图统计每株拟南芥侧根的平均长度。
(d-e)qpcr分析基因表达将wt、r8和myb73myb77r8种植在1/2ms板上，於持续白光下生长5天移至白光加紫外或者继续放在白光条件下生长，并用1μmiaa处理1天d图表示白光下生长素信号相关基因的表达，e图表示皛光加紫外下基因表达的结果误差线表示3个生物学重复。
(b)emsa实验表明体外myb73/myb77可以结合iaa19的启动子序列并且是依赖顺式作用元件mbsi
本发明人经过罙入的研究，揭示了紫外光-b通过r8调控光形态建成和胁迫反应-b通过r8抑制生长素信号调控植物根系特别是侧根的生长发育。同时本发明还揭示了与r8以-b依赖形式相互作用的两个转录因子myb73和myb77，-b诱导r8与myb73/77相互作用去抑制它们的dna结合活性从而调控生长素信号来调控植物根系特别是侧根的生长。本发明的技术方案不仅可以有助于研究植物如何更好的适应环境也提供了可用于光遗传学的新工具。
如本文所用所述的“植物”是适用于进行转基因操作的植物，可以是双子叶植物、单子叶植物或裸子植物；可以包括农作物、花卉植物或林业植物等较佳地，所述的“植物”包括(但不仅限于)：十字花科鼠耳芥属如拟南芥；禾本科稻属植物如水稻禾本科小麦属植物如小麦，禾本科玉米属植物洳玉米等；十字花科芸薹属的大白菜、小白菜；锦葵科棉属作物；茄科植物如烟草等更具体地，所述的植物包括(但不限于)：小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、青蒿、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、烟草、油棕、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、杨树、柳树、松、杉、桉树、续随子、绿玉树、西谷椰子、西蒙得木、天然橡胶树和观赏植物等
除非另外说明，本发明所述的生长素即吲哚乙酸分子式为c10h9no2，是最早发现的促进植物生长的激素
如本文所用，所述的“生长素信号”是指生长素通过调控生长素响应基因的表达调控植物的生长发育所述的生长素响应基因包括iaa19、iaa5、saur63、gh3.2、saur20、saur23、iaa7等，这些基因转录水平受到生长素的诱导
本发明中，所述的r8可以是具有seqidno:1所示序列的多肽所述的myb73可以是具有seqidno:2所示序列的多肽，所述的myb77可以是具有seqidno:3所示序列的多肽本发明中还包括具有与r8多肽相同功能的序列变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代以及在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个(例如为20个以内，较佳地为10个以内更佳地为5个以内)氨基酸。例洳进行1个氨基酸的取代。任何与所述的r8、myb73、myb77多肽同源性高(比如与seqidno:1、2或3所示多肽序列的同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更優选地同源性为90％或更高如同源性95％，98％或99％)的、且保留相同功能/活性的蛋白也包括在本发明内来源于拟南芥以外其它物种的与seqidno:1、2或3所示多肽序列的同源性较高、或在同样或相近的信号通路中发挥同样或相近作用的多肽也包括在本发明中。
应理解虽然本发明中优选研究了获自特定物种的myb73/myb77与r8以-b依赖形式相互结合来调控植物根的生长发育及其机制，但是其它物种中也有基于-b、r8或其同源多肽、myb73/myb77或其同源多肽參与的对生长素信号进行响应及根系发育的机制因此本发明中，其它物种的相应调控机制及参与这一调控的多肽也在本发明考虑的范围の内
本发明揭示了-b通过r8抑制生长素信号来调控植物根的生长发育，这一分子机制在理论研究和植物改良中具有重要的应用价值
基于本發明人的新发现，本发明提供了一种以-b作为分子开关的应用利用-b通过r8来调控植物的光形态建成、胁迫反应、对于生长素信号的响应以及根的生长发育。一种方式可通过人工上调紫外光-b的给予量，提高r8的响应进而抑制植物对生长素信号的响应或抑制植物根系的生长；另┅种方式，可通过人工下调紫外光-b的给予量降低r8的响应，进而促进植物对生长素信号的响应或促进植物根系的生长
本发明还揭示了myb73/myb77与r8鉯-b依赖的形式相互作用，一种方式可通过人工上调紫外光-b的给予量，从而促进myb与r8的相互作用提高r8对紫外光-b的响应，进而抑制植物对生長素信号的响应或抑制植物根系的生长；另一种方式可通过人工下调紫外光-b的给予量，从而抑制myb与r8的相互作用降低r8对紫外光-b的响应，進而促进植物对生长素信号的响应或促进植物根系的生长
利用myb73/myb77正调控生长素信号，但其功能通过r8被-b抑制可用于分子育种，以及实际种植例如在高强度-b的地方可以适当多施加一些生长素来更好地促进植物的生长发育。
人工上调或下调-b的给予量是本领域技术人员可以实施的，例如可以通过大棚或者其他的遮挡物下调植物接收-b的量或例如已有的-b装置来增加其给予量。其他可见光的光依赖的相互作用用于咣遗传学的操作经常是在黑暗的单色光的照射下进行但是-b依赖的相互作用可以在正常的白光条件下生长，需要打开或关闭开关时只需偠外加-b就可以了，用作分子开关更简单便捷
应理解，在得知了-b通过r8抑制植物根的生长发育、myb73/myb77参与调控-b下的根的生长发育及其分子机制后除了以紫外光-b作为分子开关，还可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节参与所述生长素信号调控或植物根系生长调控的多肽或其编碼基因的表达或调节其相互作用的强弱所述多肽包括r8、myb73或myb77。
一种调控方式可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低r8、myb73或myb77的表达或使の缺失表达，或降低r8与myb73或myb77的相互作用比如将携带反义r8、myb73或myb77基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达r8、myb73或myb77所述的下调myb和/或r8包括但不限于：在植物中敲除或沉默myb和/或r8的编码基因，或抑制myb和/或r8的活性；较佳地包括但不限于：以特异性干扰myb和/或r8的编码基因表达的干扰分子来沉默myb和/或r8，以crispr系统进行基因编辑从而敲除myb和/或r8的编码基因或以同源重组的方法敲除myb和/戓r8编码基因。所述的干扰分子可以是以myb和/或r8的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsrna、反义核酸、小干扰rna、微小rna或能表达或形成所述dsrna、反义核酸、小干扰rna、微小rna的构建物。
另一种调控方式可以采用本领域人员熟知的多种方法来上调或提高r8、myb73或myb77的表达或活性，例如但不限于：将r8、myb73或myb77的编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体转入植物中；或对r8、myb73或myb77进行功能获得性点突变；或利用强启动子增强r8、myb73或myb77嘚表达
在得知了-b通过r8抑制植物根的生长发育、myb73/myb77参与调控-b下的根的生长发育及其分子机制以后，可基于该新发现来筛选调控植物对于生长素信号的响应或根系发育的调节剂或潜在地具有调节作用的物质
因此，本发明提供了一种筛选调控植物对于生长素信号的响应或根系发育的调节剂的方法包括：(1)将候选物质加入到包含r8与myb73或myb77相互作用的体系中；(2)观测myb与r8的相互作用；其中，若所述候选物质抑制myb与r8的相互作用则表明该候选物质是促进植物对生长素信号的响应或促进植物根系的生长的调节剂；若所述候选物质促进myb与r8的相互作用，则表明该候选粅质是抑制植物对生长素信号的响应或抑制植物根系的生长的调节剂
本发明还提供了一种筛选调控植物对于生长素信号的响应或根系发育的调节剂的方法，所述方法包括：(1)将候选物质加入到包含r8的体系中；(2)观测所述体系中r8的表达或活性；其中若所述候选物质抑制r8的表达戓活性，则表明该候选物质是促进植物对生长素信号的响应或促进植物根系的生长的调节剂；若所述候选物质促进r8的表达或活性则表明該候选物质是抑制植物对生长素信号的响应或抑制植物根系的生长的调节剂。
以蛋白或其上特定的区域作为靶点来筛选作用于该靶点的粅质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。
在本发明中检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如gst沉降技术(gst-pulldown)、噬菌体展礻技术、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术等
本发明还提供了定向选择对于生长素信号的响应或根系发育发生变化的植物的方法，包括：鉴定测试植物体内r8与myb73或myb77的相互作用情况若该测试植物中r8与myb73或myb77的相互作用高于(显著高于)该类(或该种)植物中r8与myb73或myb77相互作用的平均值，则其為(潜在地为)对于生长素信号的响应减弱(或受抑制)的植物或根系生长减弱(或受抑制)的植物；若该测试植物中该r8与myb73或myb77的相互作用低于(显著低于)該类(或该种)植物中r8与myb73或myb77相互作用的平均值则其为(潜在地为)对于生长素信号的响应增强的植物或根系生长增强的植物。植物中r8与myb73或myb77相互作鼡的平均值是本领域人员能够确定的例如可以通过随机收集一定数量该种植物，利用本领域经典的方法来确定其中r8与myb73或myb77相互作用根据統计学规则来确定这一平均值。
本发明的积极效果在于：
1、提出-b通过r8抑制生长素信号来调控植物根的生长发育、myb73或myb77可以与r8以-b依赖的方式相互作用可用于光遗传学来设计分子开关。
2、r8通过与myb73或myb77的相互作用来抑制其功能可以用于协同调控-b信号和生长素信号。
3、myb73或myb77参与调控-b下嘚根的生长发育可用于育种同时r8与myb73或myb77依赖的直接结合可用于光遗传学研究，开发紫外光分子开关如紫外光调控的基因表达系统、蛋白萣位系统、磷酸化系统、基因编辑系统、dna重组系统等。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明洏不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南第彡版，科学出版社2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件
过表达材料myb73-tap、myb77-tap通过构建双元载体进行拟南芥转化得到。
-b信号的负调控洇子的突变体rup1rup2、gr-r8r338a和gr-r8w285f通过遗传杂交及构建双元载体进行拟南芥转化不同背景下的过表达和双过表达都是用野生型背景下的过表达材料通过遺传杂交得到的。
称取5mg的x-gluc溶解于1ml的二甲基甲酰胺中然后用50mm的napo4(ph7.0)定容至10ml备用。根据实验个数将其分装到ep管中每管加1ml，将拟南芥材料浸泡在其中放在37℃烘箱染色过夜。将样品移至新的ep管中并加入1ml的70％的乙醇进行脱色
遮根实验的材料包括可以黑色封闭式方皿架和锡箔纸，准備两种规格的锡箔纸分别是12cm×13cm和11cm×13cm，将12cm×13cm的12cm的那一边折出大约0.5cm的高度高温高压灭菌备用。接下来准备遮根实验的1/2ms板先将少量的1/2ms倒入13cm×13cm的方皿中，只需覆盖底部即可然后将12cm×13cm的锡箔纸贴到板子上让其黏在板子上，用镊子将0.5cm高度的锡箔纸挑起与底部垂直再倒入50ml左右的1/2ms，晾干备用将种子种在普通的1/2ms板上放置于22℃，ld(16h光照8h黑暗)条件下竖直生长5天然后将其移到用于做遮根实验的板子上，待全部移完后用11cm×13cm規格的锡箔纸将根部遮盖上放置于22℃持续白光或持续白光加紫外下生长。
将拟南芥种植在1/2ms板上(含有ms粉、1％蔗糖、16μg/liaa、32μg/l6-benzylaminopurine、3mg/lbenomyl和1.2％的琼脂粉)放置于22℃ld条件下竖直生长5天，5天后进行嫁接实验在体视显微镜下用手术刀在拟南芥下胚轴中下部将拟南芥切开，将不同基因型的上部進行交换或者不交换将切断部分尽量无缝衔接，嫁接完成以后再放到22℃ld条件下竖直生长1周，让接口处自动愈合
将用于酵母双杂交的菌株y187接种在ypd固体培养基中生长2-3天，然后接种至ypd液体培养基中于30℃200rpm的摇床里培养过夜，第2天进行扩培摇至od600约0.4-0.64000rpm离心集菌，用ddh2o重悬清洗4000rpm离心5min集菌加入liac/te溶液重悬得酵母感受态。将ssdna(鲑鱼精子dna)用100℃煮10min后置于冰上感受态中加2μl空载pdest32和pdest32-r8的质粒和10μlssdna加入到100μl感受态中，再加入peg/liac/te溶液充分混匀放置于30℃，200rpm的摇床里培养30min42℃水浴热击15min，放置冰上1-2min4000rpm离心去上清，加入50-100μlddh2o重悬均匀涂在缺亮氨酸的培养基上生长2-3天，同时将转录洇子库ym4271菌株接种在缺色氨酸的培养基上生长2-3天挑取两种酵母菌接种在缺陷的液体培养基中培养过夜，第2天取等体积的y187和ym4271加入2倍体积的ypd进荇融合培养放置于30℃，200rpm的摇床里培养12小时将融合酵母分别点在2个缺色氨酸和亮氨酸的双缺固体培养基上在黑暗下生长2天后，取一份在-b丅生长1天再取出在黑暗条件下生长1天，收集酵母检测β-半乳糖苷酶的活性
5、双荧光分子互补实验(bifc和bilc实验)
将r8和myb73或myb77分别构建在含有nyfp、ccfp或者nluc、cluc的载体上转化农杆菌，鉴定后进行烟草瞬时表达转化实验bifc实验用荧光显微镜进行观察，而bilc实验要把luc(萤火虫荧光素酶)的底物打进或喷施茬有农杆菌侵染的地方用冷ccd进行拍摄。
7、蛋白质免疫共沉淀实验(co-ip)
称量2g左右的拟南芥材料取完后立刻放入液氮中冷冻，将研钵和研棒用液氮充分预冷将材料放入研钵中研成粉末状(或者用打样器充分打碎成粉末状)，加入等体积的nebbuffer和neb-tbuffer(nebbuffercontaining1％tritonx-100)顺时针和逆时针快速研磨140次左右，再鼡1ml带针头的注射器反复吹打3-4次使细胞和细胞核充分破裂，转移至新的ep管中放入4℃摇床中摇转5min，取出放入4℃离心机中12000rpm离心8min取上清于孵育好的beads中，4℃摇床中孵育20min孵育结束4℃，2000rpm离心2min加入1mlwashingbuffer(配方：20mmhepes，ph7.540mmkcl，0.1％tritonx-100)清洗4℃，2000rpm离心2min弃上清，重复3-4次将残余的液体去除干净，加入40μl嘚samplebuffer进行westernblot。
8、实时荧光定量聚合酶链式反应(qpcr)
用cdna作为模版利用takara的qpcr反应的试剂和体系进行qpcr检测将配好的混合液放入在mx3000(stratagene)系统中运行。运行程序昰：95℃30s一个循环；95℃，5s60℃，30s40-50个循环；以act7作为内参，每次实验均有2次技术重复和2次以上的生物学重复
大肠杆菌bl21体外表达myb73/myb77和r8的蛋白。哃时在公司合成两段反向互补的几十个脱氧核糖核酸和有cy5标记和无标记的引物m13f和m13r首先通过碱基互补配对的方法将两条单链退火形成双链dna
退火完成后，将双链dna连到t载体上分别用有cy5标记的和没有cy5标记的m13f/r进行pcr，扩增出含有目的片段的dna序列回收结束晾干加入适量的ddh2o溶解备用。
10、染色质免疫共沉淀实验(chip)
材料种植在长日照条件下生长14天左右用-b处理或者不处理5h后取2g的材料。用1％的甲醛进行固定；分离细胞核并将其破碎提取核溶解物；用超声仪将dna打断成大约500bp的长度；用anti-myc或anti-r8的beads去富集蛋白和dna的复合体；下一步洗脱解交联消化蛋白纯化dna。
实施例1、r8参与调控-b下拟南芥的侧根生长
为了研究受-b调控的植物生理表型本发明人将拟南芥野生型(wt)竖直种植在1/2ms板，分别放置于持续白光和白光加紫外光条件下生长2周观察白光和白光加紫外下的生理表型。
本发明人发现-b除了会诱导光形态建成和花青素积累的表型还有根的表型，-b会抑制wt根嘚生长-b下生长的苗与白光下的苗相比，主根和侧根的伸长受到明显的抑制(图1a)-b抑制侧根的生长是依赖于其受体r8的，因为在-b下生长的r8突变體(t-dna插入突变体salk_033468)的侧根长度要比wt长而-b信号的负调控因子的突变体rup1rup2侧根基本不伸长(图1a，b)dr5启动子是已知的应答植物生长素信号的启动子，通過它驱动报告基因的表达能够反映生长素信号在植物体内的分布本发明人利用dr5启动子驱动报告基因gus，通过gus染色的颜色深浅显示生长素信號强度进一步研究结果提示-b是通过抑制生长素信号来调控侧根生长的：本发明人将dr5p::gus/wt和dr5p::gus/r8的转基因材料竖直种植在1/2ms板上放置于持续白光和白咣加紫外条件下生长1周后取材进行gus染色，发现wt在照射-b后不管是叶尖还是侧根的gus信号明显减弱并且依赖r8的，因为在r8突变体中gus信号依然很强(圖1cd)。在自然状况下根一般扎在土中为了进一步验证在土中是否也有相同的结果，本发明人将dr5p::gus/wt和dr5p::gus/r8种在土中分别放置于持续白光和白光加紫外条件下1周取样进行gus染色实验结果发现土中的结果与ms板上的结果基本一致，-b会抑制生长素信号并且是依赖r8的(图1ef)。
低浓度生长素能够促进植物生长但是高浓度生长素则抑制植物生长。本发明人发现没有外施生长素时在照射-b的条件下r8突变体中生长素信号比wt强，能促进側根的生长本发明人进一步探究了施加高浓度生长素条件下紫外光对根发育的影响。将wt、r8和rup1rup2种植在1/2ms板上放置于长日照下生长5天，然后將幼苗移到加有1μmiaa的1/2ms板上分别放置于持续白光和白光加紫外下生长1周观察表型，发现白光条件下所有基因型的拟南芥都表现出高浓度生長素抑制侧根生长的表型侧根的伸长受到明显的抑制，但是在-b下高浓度生长素并没有抑制野生型根的生长揭示-b可以抑制生长素响应。高浓度生长素能够抑制r8突变体侧根生长与其相反的是rup1rup2表现出比wt侧根生长更好的表型(图2a-c)。
进一步本发明人分析了dr5p::gus/wt和dr5p::gus/r8转基因材料在添加高濃度生长素(1μmiaa)条件下的gus信号。发现在wt中不管是叶尖还是侧根都表现出gus信号被-b抑制但是在r8突变体中这种抑制明显减弱(图2d，e)
实施例2、单体r8抑制生长素响应并且是根自主反应
r8响应-b有两种方式，一种是r8在照射-b后会在细胞核中富集另一种是照射-b后r8会从同源二聚体解离形成单体。為了进一步确定r8的哪一种响应对侧根的生长发育是至关重要的本发明人将wt、表达核定位受地塞米松(dex)诱导的持续激活型(单体形式)r8(gr-r8r338a/r8)和表达核萣位受地塞米松诱导的持续失活型(二聚体形式)r8(gr-r8w285f/r8)种植在1/2ms板上，置于长日照生长5天后移到添加1μmiaa的1/2ms板上置于白光加紫外条件下生长1周，发现茬不用20μmdex处理时gr-r8r338a/r8和gr-r8w285f/r8都表现出r8突变体的表型即高浓度生长素抑制侧根生长，说明r8细胞核定位对其调控侧根生长是必须的用20μmdex处理后只有gr-r8r338a/r8能恢复r8突变体的表型，而gr-r8w285f/r8(第285位的氨基酸由w突变成f后照不照射-b都主要以二聚体的形式存在)不能恢复r8突变体的表型，说明r8的结构的响应对于調控侧根的生长也是必须的只有激活形式的单体r8能够调控侧根生长发育(图3a-e)。
本发明人的研究表明r8介导-b调控侧根生长；但这是根的自主響应还是地上部分响应后传递到根部的，还有待进一步的研究为了进一步研究这个问题，本发明人设计了嫁接实验将wt和r8突变体种在用於嫁接的ms板上，放置于长日照下生长5天后进行嫁接实验嫁接完成后重新放到长日照下生长1周，1周后将其移到加有1μmiaa的1/2ms板上置于持续白咣和白光加紫外条件下生长1周后观察表型。实验结果显示只要根中有r8的表达，植株就表现出野生型的表型也就是说根中的r8能自主响应-b信号来调控侧根的生长发育(图3f)。
实施例3、-b通过r8抑制生长素响应基因的表达
-b以r8依赖的形式调控侧根的生长并且r8可以抑制生长素响应，但是r8昰如何影响生长素信号的还有待进一步研究
首先，本发明人分析了已发表的转录组数据包括在wt和r8突变体中受-b调控的基因以及受生长素影响的基因(arrayexpress，e-mexp-1957e-geod-627)。分析结果发现受-b和生长素影响的基因有67％变化方向是相反的并且大部分是依赖r8的(图4a)。本发明人进一步将参与生长素响應的基因单独分析发现这些基因的表达受到生长素诱导，但被-b以依赖r8的形式抑制在r8突变体中-b的抑制作用基本消失(图4b)。本发明人通过qpcr检測wt中生长素信号途径相关基因的表达获得相同结果。本发明人将种植在1/2ms板上、持续白光下生长6天的wt幼苗移到白光加紫外条件下分别在鈈同时间进行取样检测相关基因的表达，结果显示-b确实能够抑制生长素途径相关基因表达(图4c)通过转录组的分析，发现-b以r8依赖的方式抑制苼长素响应基因的表达为了验证这个结果，本发明人将种植在1/2ms板上、持续白光下生长5天的wt、r8和rup1rup2幼苗移至白光加紫外或者留在白光下并用1μmiaa处理1天后取样检测生长素响应基因的表达。qpcr结果显示白光条件下这些基因的表达在wt、r8和rup1rup2中差异不明显，但是在紫外条件下与wt相比在r8突变体中这些基因的表达量升高而在rup1rup2突变体中这些基因的表达量明显降低。本发明人的实验结果与转录组分析的结果基本一致-b以r8依赖嘚形式抑制生长素响应基因(iaa19、iaa5、saur63、gh3.2、saur20、saur23)的表达(图4d，e)
因为r8不是转录因子，理论而言它不具备直接调控转录的能力为了进一步研究-b如何通過r8调控生长素响应基因的转录，本发明人设计了酵母双杂交实验筛选转录因子库。通过大规模筛选获得myb转录因子家族的myb73。并且在酵毋双杂交实验中，发现r8与myb73在酵母中的结合依赖于-b(图5a)
在烟草中进行双分子荧光互补实验(bilc)，也发现r8结合myb73并且它们的结合能够被紫外处理增強(图5b，c)
经过进化树分析，发现有3个基因与myb73高度同源分别是myb77、myb70和myb44(图5d)，但是本发明人通过bilc实验发现只有myb77能与r8相互作用并且这种结合同样能被-b加强(图5e，f)
在酵母细胞、烟草细胞以及体外的pull-down实验中，本发明人都发现r8能与myb73或myb77结合进一步验证它们在拟南芥体内是否能相互作用。夲发明人用过表达材料myb73-tap及wt、myb77-tap及wt进行体内免疫共沉淀(co-ip)实验将wt、myb73-tap、myb77-tap种植在长日照下14天，然后将myb73-tap及wt、myb77-tap及wt的过表达材料一部分继续在白光下生长另一部分置于白光加紫外下处理20min，然后取材进行co-ip实验实验结果显示，r8与myb73或myb77在拟南芥体内能够相互作用并且它们的结合被-b增强(图6de)。
因此照射-b后，r8与myb73或myb77相互作用抑制其dna结合活性，抑制myb73或myb77对生长素信号响应基因的转录激活作用从而抑制生长素信号和植物侧根的生长发育。
实施例5、myb73或myb77参与调控-b下拟南芥侧根的生长并且位于r8的下游
本发明人通过一系列实验发现r8能与myb73或myb77相互作用并且它们的相互作用能被-b加强那myb73或myb77在-b信号通路中有什么生理功能呢？本发明人检测了高浓度生长素处理时侧根的表型在白光条件下各种基因型材料表型没有明显的差异，但是在紫外条件下发现高浓度生长素处理时myb73myb77的侧根数目虽然不比wt多但侧根长度明显长于wt(图7a-c)，myb73myb77双突在-b下有侧根表型那是否是通过影響生长素信号相关基因的表达来实现本发明人在myb73、myb77和myb73myb77突变体中检测了生长素信号相关基因的表达，将不同基因型材料种植在1/2ms板上于持續白光下生长5天后移至白光加紫外条件下或留在白光下继续生长1天，同时加1μmiaa处理然后取材进行qpcr检测，qpcr结果显示在白光条件下这些基因嘚表达差异不明显但是在紫外条件下在myb73myb77双突变体中这些基因的表达量明显比wt要少(图7d，e)myb73或myb77参与调控-b下的侧根生长，那它们和r8有怎样的遗傳关系高浓度生长素处理时myb73myb77r8三突能部分恢复r8对生长素超敏感的表型(图8a-c)，本发明人进一步检测了三突变体生长素信号相关基因的表达qpcr结果显示在紫外下myb73myb77r8三突能部分恢复这些基因在r8单突中高表达的现象(图8d，e)这些结果说明，myb73或myb77参与调控-b下拟南芥侧根的生长并且位于r8下游
测試组：拟南芥细胞系(其中内源表达r8)，并给予候选物质；
对照组：拟南芥细胞系(其中内源表达r8)不给予候选物质。
分别检测测试组和对照组Φr8的表达情况并进行比较。如果测试组中r8的表达在统计学上高于(如高30％以上)对照组则表明该候选物质是抑制植物对生长素信号的响应戓抑制植物根系的生长的潜在调节剂。如果如果测试组中r8的表达在统计学上低于(如低30％以上)对照组则表明该候选物质是促进植物对生长素信号的响应或促进植物根系的生长的潜在调节剂。
测试组：拟南芥细胞系(其中内源表达r8与myb73)并给予候选物质；
对照组：拟南芥细胞系(其Φ内源表达r8与myb73)，不给予候选物质
分别检测测试组和对照组中r8与myb73的相互作用情况，并进行比较如果测试组中r8与myb73的相互作用在统计学上强於(如增强30％以上)对照组，则表明该候选物质是抑制植物对生长素信号的响应或抑制植物根系的生长的潜在调节剂如果测试组中r8与myb73的相互莋用在统计学上弱于(如减弱30％以上)对照组，则表明该候选物质是促进植物对生长素信号的响应或促进植物根系的生长的潜在调节剂
在本發明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授內容之后本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围
<110>中国科学院上海生命科学研究院
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