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【求助】SDS-PAGE胶的凝固疑问
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最近在做WB，已有资料表明，分离胶一般30-60min，浓缩胶15-30min即可凝固，可我灌的胶（10％分离胶，AP用量为0.05ml，TEMED为0.002ml；5％浓缩胶，AP用量为0.02ml，TEMED为0.002ml）一般都需2h以上才凝固的比较好。
昨天灌胶，浓缩胶经2h后仍不能完全凝固，表现为插梳子的部分呈液体。
请问该如何解决呢？查看完整版本请点击这里：
eric930 ( 18:15:28)
你用的AP是否是新鲜配置，即使不是，也得放在四度冰箱里保存。另外，TEMED的量少了，建议上10微升。如果凝的速度慢，也可放入37度恒温箱里。在拔梳子之前，先左右晃动，看看梳齿之间的胶凝了没有。祝好。
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最近在做WB，已有资料表明，分离胶一般30-60min，浓缩胶15-30min即可凝固，可我灌的胶（10％分离胶，AP用量为0.05ml，TEMED为0.002ml；5％浓缩胶，AP用量为0.02ml，TEMED为0.002ml）一般都需2h以上才凝固的比较好。
昨天灌胶，浓缩胶经2h后仍不能完全凝固，表现为插梳子的部分呈液体。
请问该如何解决呢？
101010 ( 18:15:49)
（10％分离胶，AP用量为0.05ml，TEMED为0.002ml；5％浓缩胶，AP用量为0.02ml，TEMED为0.002ml）
分别为10％分离胶5ml和5％浓缩胶 2ml的用量吧？
过硫酸铵试剂时间长吗？因AP易水解，释放出氧。另外，AP液要新配。
我也碰到过，换过硫酸铵后问题解决。
any333 ( 18:16:07)
谢谢各位。我的AP是昨天刚配的。我准备将TEMED的量加大，再试！
any333 ( 18:16:45)
胶终于凝了，只是我还有疑问，AP与TEMED的量总不能随便加吧，有什么原则吗？
redbutterfly ( 18:17:04)
当然不能随便加,如果AP与TEMED过量在电泳是可能烧胶,是蛋白质变性影响实验结果,如果你在正常量下不易凝胶,你可以稍加一点但不要太多.或者你可以把浓缩胶配到12%试一试!
standbyme ( 18:17:21)
还有可能是TEMED失效，虽然是常温条件可以存放，但我们实验室师兄们都是4度保存的，因为你AP新的，所以应该还是这个有问题，量并不决定一切，我2ul在30mins都凝了。
NBA ( 18:17:50)
如果你的胶是小板体系，也就是大约4ml分离胶，1ml浓缩胶，那么2ulTEMED也已经足够了，我估计最可能问题出在10％的AP是不够新鲜已经过期的。建议
1：重新配置10％AP。平时分管保存在—20度，我得经验是3个月仍旧有效
2：如果用新鲜10％AP没有解决问题，那么就要怀疑AP固体是否有问题，然后是TEMED（观察是否变黄，如变黄，则失效可能性很大）
3：使用新的AP和TEMED不能排除问题，则考虑配置的30％丙烯酰胺是否有误，浓度是否正确。新手可能是30g混合物加上100ml水配置的，那样，终浓度下降，凝固时间大大延长。
4：仍旧解决不了问题，只有怀疑药品失效。
关于温度，即使放到冰箱里，2个小时也可以凝固了，不会是你问题所在。
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最近在做WB，已有资料表明，分离胶一般30-60min，浓缩胶15-30min即可凝固，可我灌的胶（10％分离胶，AP用量为0.05ml，TEMED为0.002ml；5％浓缩胶，AP用量为0.02ml，TEMED为0.002ml）一般都需2h以上才凝固的比较好。
昨天灌胶，浓缩胶经2h后仍不能完全凝固，表现为插梳子的部分呈液体。
请问该如何解决呢？
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The nucleic acid samples on the gel are fine, but with too much RNA. Do RNase A digestion and run gel again.
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聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶，是由丙烯酰胺单体（Acr）和少量的交联剂N，Nˊ-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂（过硫酸胺或核黄素）和加速剂（N， N，NˊNˊ-四甲基乙二胺）的作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶为支持物的电泳称聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。前者电泳体系中缓冲液pH及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中的泳动主要靠电荷和分子筛效应；后者电泳体系中缓冲液离子成分、、凝胶浓度及电位梯度是不连续的，带电颗粒在电场中的泳动不仅主要靠电荷和分子筛效应，还有浓缩效应。PAGE所具有的分子筛效应、浓缩效应和电荷效应大大提高了蛋白的分辨率。SDS－PAGE电泳的基本原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。具有机械性能好、化学性能稳定、灵敏度好、分辨率高的优点。PAGE应用十分广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量和少量制备，还可测定分子量和等电点等。胶缓冲液系统的配制在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。蛋白在浓缩胶浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；TEMED与AP加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。凝胶配制根据凝胶配方和分离蛋白的需要配制聚丙烯酰胺凝胶。待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。样品处理根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。1、还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。2、带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。3、非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。蛋白质染色电泳后蛋白质染色目前常用的是考马斯亮蓝法，其比氨基黑染色法灵敏度高，可以进行定量扫描，比银染法简便。常见问题及处理办法1:拖尾现象主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。2：“微笑”（两边翘起中间凹下）形带主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。3：“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。4：电泳的条带很粗电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；为5： “鬼带”，如何处理？“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。6：电泳电压很高而电流却很低这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。处理办法：电泳槽正确装配即可。7：出现纹理现象主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。8：溴酚蓝不能起到指示作用我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。9：浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡A：这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。处理办法：按正确的操作方法操作。英格恩生物
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试着 稀释DNA的浓度，上样量减少。严格制胶，还有染料 会不会拖尾。有问题留言。
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没啥问题，往下继续做实验吧。
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11:29:41 | 来自
强烈要求北京现代解决升级后诸多问题
自从升级后瞬时油耗满格动力笨拙油耗居发动机噪音加强为什么有部分车友指升级后动力油耗难成途胜同批次有区别
引用 床板太硬
11:29:41 发表于 主楼 的内容：
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完成汽车之家·知道升级任务，解答问答，并被提问者采纳为满意回答，可得解答达人一级勋章
完成汽车之家·知道解答问答任务，并被提问者采纳为满意回答。并符合升级规则，即可得解答达人二级勋章
引用 2016我的爱车
11:31:11 发表于 1楼 的内容：
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11:33:33 | 来自
恶心的升级
引用 床板太硬
11:33:33 发表于 2楼 的内容：
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11:29:41 发表在 自从升级后，瞬时油耗满格，动力笨拙，油耗居高不下，发动机噪音加强，为什么有部分车友指升级后动力好了，油耗低了，难不成途胜不同批次有区别我的车是7月28出厂的，应当是升级过的TCU，现在跑了4500公里，综合油耗6个。莫非你买到的车有问题？要不就是你在前1000公里使用中出了问题。当然我平均时速32.，你的平均时速又是多少？你平均时速如果15，那么你这油耗也并不奇怪啊。其它的车在这时速起码15个。
引用 lilac-10 11:36:21 发表于 3楼 的内容：
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11:36:34 | 来自
恶心的升级找上4儿子，把我的平均油耗显示方式调了，我不懂，不要忽悠。没升级前显示方式可也是现在显示高油耗的格式
引用 床板太硬
11:36:34 发表于 4楼 的内容：
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11:39:45 | 来自
11:36:21 发表在 我的车是7月28出厂的，应当是升级过的TCU，现在跑了4500公里，综合油耗6个。莫非你买到的车有问题？要不就是你在前1000公里使用中出了问题。当然我平均时速32.，你的平均时速又是多少？你平均时速如果15，那这么油耗平奇怪啊。其它的车在这时速起码15个。真是磨合期产生的问题也不应该在升级后出现新车不到一个月就换了游丝，和方向机（打方向间歇性异响）
引用 床板太硬
11:39:45 发表于 5楼 的内容：
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11:39:45 发表在 真是磨合期产生的问题也不应该在升级后出现新车不到一个月就换了游丝，和方向机（打方向间歇性异响）那说明你的是问题车了咧，找4S死磕！
引用 lilac-10 11:41:15 发表于 6楼 的内容：
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11:42:33 | 来自
11:41:15 发表在 那说明你的是问题车了咧，找4S死磕！我是3月份订的车，4月份提车
引用 床板太硬
11:42:33 发表于 7楼 的内容：
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11:42:33 发表在 我是3月份订的车，4月份提车同样都是途胜，你的和我的差距怎么就这么大呢？
引用 lilac-10 11:45:34 发表于 8楼 的内容：
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11:46:59 | 来自
11:45:34 发表在 同样都是途胜，你的和我的差距怎么就这么大呢？我也想知道
引用 床板太硬
11:46:59 发表于 9楼 的内容：
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11:47:36 | 来自
我目前提车一月，700多公里还没出现有什么问题，持续关注！
引用 随意之车
11:47:36 发表于 10楼 的内容：
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11:50:53 | 来自
我和楼主情况一样一样，发动机响，轻踩油表一下就20多
引用 8848钛金手机何振兴
11:50:53 发表于 11楼 的内容：
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12:17:25 | 来自
11:29:41 发表在 自从升级后，瞬时油耗满格，动力笨拙，油耗居高不下，发动机噪音加强，为什么有部分车友指升级后动力好了，油耗低了，难不成途胜不同批次有区别我 去保养就没有让他们升级，我感觉现在开着挺好的
引用 王文友友
12:17:25 发表于 12楼 的内容：
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升级了增加了平顺性，燃油油耗显示只是参照，你刚加完油油耗指数也会变，要长期手动统计为准。好好研究研究吧。
潇洒的活着比什么都好。
引用 16-11-10 13:11:06 发表于 13楼 的内容：
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13:11:06 发表在 升级了增加了平顺性，燃油油耗显示只是参照，你刚加完油油耗指数也会变，要长期手动统计为准。好好研究研究吧。求解，如果只是参考，为什么大多数车主油耗表显却是和升级前差不多，而像我这样，表显差别这么大
引用 床板太硬
13:28:36 发表于 14楼 的内容：
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13:28:36 发表在 求解，如果只是参考，为什么大多数车主油耗表显却是和升级前差不多，而像我这样，表显差别这么大什么叫大多数，你统计过没有，刚升级，行车电脑相当于重启，关于油耗就相当于你刚提车的状态，用一段时间你就会发现了什么油耗变得更高，都是扯淡。尤其是你用这次的油，加了新油再看看。
潇洒的活着比什么都好。
引用 16-11-10 13:32:52 发表于 15楼 的内容：
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兄弟，我这是第2箱油了
引用 床板太硬
13:35:44 发表于 16楼 的内容：
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所属：爱车：
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11:29:41 发表在 自从升级后，瞬时油耗满格，动力笨拙，油耗居高不下，发动机噪音加强，为什么有部分车友指升级后动力好了，油耗低了，难不成途胜不同批次有区别我的也是3月份的，升级后感觉很好啊，油耗是比原来高点，也就是1升不到的样子，原来是7.8，现在是8.7，市内油耗
引用 为爱停留-10 14:53:41 发表于 17楼 的内容：
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所属：关注：
你们都不用节能模式吗？ & 节能模式 是8.几 & &要是标准模式 & 油耗也也是 14.。。。
引用 leibing199
15:42:38 发表于 18楼 的内容：
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20:11:55 | 来自
14:53:41 发表在 我的也是3月份的，升级后感觉很好啊，油耗是比原来高点，也就是1升不到的样子，原来是7.8，现在是8.7，市内油耗纯市区油耗8.7左右？？
引用 床板太硬
20:11:55 发表于 19楼 的内容：
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20:12:22 | 来自
15:42:38 发表在 你们都不用节能模式吗？ & 节能模式 是8.几 & &要是标准模式 & 油耗也也是 14.。。。
引用 床板太硬
20:12:22 发表于 20楼 的内容：
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