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检测荧光素酶报告基因发出荧光的都有什么仪器?例如各有什么优缺点之类的?
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Luminex,荧光分光光度仪,荧光凝胶成像仪,液闪仪 ,荧光酶标仪,荧光显微镜都很贵.推荐荧光酶标仪和荧光显微镜.Luminex是液体芯片测定,同时检测30个目的蛋白,定量,灵敏.荧光分光光度仪用途比较局限,不方便.荧光凝胶成像仪的对象是凝胶液闪仪和luminex很像,但是只能检测一个蛋白或靶标荧光酶标仪就是酶标仪,但是可以检测荧光信号,同时可以测定至少96个样品的单一靶标荧光显微镜不能定量,但非常直观,可以看到是那些细胞发光,以及发光的部位.而且可以同时看到1-3种荧光,价格比前者低些.
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双荧光素酶检测的原理和应用
双荧光素酶检测的原理和应用
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一、荧光素酶报告基因的检测原理荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物。自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。目前，以北美萤火虫虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛，该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。发光机制生物荧光实质是一种化学荧光。萤火虫荧光素酶在Mg2+、ATP、O2的参与下，催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧，产生激活态的氧化荧光素，并放出光子，产生550～580 nm 的荧光，其化学反应式如下。
这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光，其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白(GFP)。荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光，特异性很强，灵敏度高，由于没有激发光的非特异性干扰，信噪比也比较高。 二、荧光素酶报告基因的检测流程1、重组质粒制备: 制备含有待检测基因-Luc/Rluc的重组质粒；2、细胞系选择: 根据实验需要选择细胞株，通常选择转染效率较高的293T细胞或原代细胞等；3、共转染: 将带有Luc/Rluc标记的报告基因和目的基因进行共转染，设置不同的检测时间点，一般为24h/48h；4、外界干预: 转染后，可进行物理/化学/病毒等的相应刺激；5、细胞处理: 采用进口/国产双荧光素酶检测试剂盒依照protocol操作；6、荧光检测: 使用GENios Pro 酶标仪或具有类似检测功能的设备进行荧光强度检测。三、荧光素酶报告基因的优点1、优越的灵敏度，比Westernbloting灵敏度高1000倍以上；2、内源性低，哺乳动物无内源性表达；3、荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响；4、发光检测，检测方便；5、灵敏度高，10‐20摩尔荧光素酶分子；6、检测范围广，大于7个数量级。
双荧光素酶检测结果示例 四、主要应用领域1、潜在启动子/启动子核心区域检测；2、潜在增强子/抑制子等调控子核心元件检测；3、启动子区可能的转录因子结合位点检测；4、启动子/增强子与转录因子的相互作用；5、病毒/细胞相互作用；6、药物等化学诱导因素对启动子活性的调节（抑制或增强）；7、射线等物理诱导因素对启动子活性的调节（抑制或增强）。 五、荧光素酶报告基因检测方法与Western-Blot检测方法在细胞信号转导通路调控机制研究中的区别1、荧光素酶报告基因检测是测定上游刺激对下游靶基因在转录水平的影响，即对靶基因mRNA表达水平的影响，可以通过实时荧光定量PCR来验证；Western blot是测定上游刺激对下游靶基因对应的蛋白表达水平的影响，特别是磷酸化程度的改变。因此，两方面的实验结果可以结合起来更细致、更全面地揭示细胞信号转导调控的分子机制。2、荧光素酶报告基因检测方法操作过程相对简单，检测灵敏度较高；Western blotting操作过程繁琐，检测灵敏度较低。3、荧光素酶报告基因检测只需要成功将含有目标DNA序列插入到报告载体中，即可进行后续实验，Western blotting则需要购买商品化的一抗，一般价高量少，且抗体的杂交条件需要摸索；若自制的一抗，抗体效价需要验证，实验周期较长。 六、参考文献Pan, Y., R. Geng, N. Zhou, G. F. Zheng, H. Zhao, J. Wang, C. M. Zhao, X. B. Qiu, Y. Q. Yang and X. Y. Liu (2015). &TBX20 loss-of-function mutation contributes to double outlet right ventricle.& .Sterling, L., M. Walter, D. Ting and B. Schule (2014). &Discovery of functional non-coding conserved regions in the alpha-synuclein gene locus.& 3: 259.Xu, R. X., R. Y. Liu, C. M. Wu, Y. S. Zhao, Y. Li, Y. Q. Yao and Y. H. Xu (2015). &DNA Damage-Induced NF-kappaB Activation in Human Glioblastoma Cells Promotes miR-181b Expression and Cell Proliferation.&35(3): 913-925.Yu, T., R. Cao, S. Li, M. Fu, L. Ren, W. Chen, H. Zhu, Q. Zhan and R. Shi (2015). &MiR-130b plays an oncogenic role by repressing PTEN expression in esophageal squamous cell carcinoma cells.&15(1): 29.作者：诺赛基因 武刚整理
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【求助】用于检测双荧光素酶报告基因的细胞究竟是应该同时转染两种质粒呢还是只需一个质粒上面同时含两种荧光素酶报告基因？谢谢
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来源：丁香园论坛
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向大家请教关于双荧光素酶报告基因检测系统与单荧光素酶报告基因检测系统的问题，两者的区别我基本清楚了，只是我没弄清楚用于检测的细胞究竟是应该同时转染两种质粒（分别含虫荧光素酶报告基因和海肾荧光素酶报告基因）呢还是只需一个质粒上面同时含两种荧光素酶报告基因？还有一个问题是如果是要转染两种质粒的话，是只需在含虫荧光素酶基因质粒中插入所要检测的调控元件基因，还是两种质粒中的荧光素酶基因前都要插入调控元件？谢谢
同时转染两种质粒,海肾荧光素酶报告基因质粒不需做任何改造，直接用就行。
谢谢了，请问你以前做过这种实验吗，同时转染两种质粒，转染率怎么样，与只转染一种相比是不转染率要低一些？
想必楼主现在都是高手了吧，请问这两者的区别在哪里啊？双荧光素酶报告基因多了一个内参照，排除了转染的差异吗？求经验
bear101777
假设第一组细胞转入100个质粒萤火海肾各50 第二组细胞转入1000个质粒萤火海肾各500个 在插入的调控基因水平一样的情况下 如果没有海肾做对照你就会得出后者调控能力是前者10倍的错误结论 而如果除以海肾后再比较就会发现俩组是同样的
我想在做的是转一个质粒，质粒上有两种报告基因，但是做出来的结果不稳定，求帮助
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