本发明属于神经示踪剂技术领域特别是涉及新型红色荧光纳米神经示踪剂。

霍乱毒素B亚基(Cholera Toxin Bsubunit,CTB):是霍乱毒素中无毒性的部位可以特异性与神经细胞表面的神经节苷脂GM1位点特異结合，并随轴浆流逆行运输至神经元胞体、树突及轴突末梢是一种灵敏度很高的逆行神经示踪剂。

荧光纳米神经示踪剂：以荧光纳米粒子的作为指示剂标记神经示踪剂，合成新型荧光示踪剂利用荧光纳米粒子较高荧光强度和荧光稳定性等优点，直观准确检测周围神經损伤后神经再生水平

目前神经示踪技术依赖免疫组化或者免疫荧光反应，步骤繁琐而且目前部分荧光神经示踪剂荧光性质不稳定，熒光强度较弱如中国发明专利申请.9——活细胞内蛋白的免疫荧光标记方法，其利用免疫荧光反应作为神经示踪步骤繁琐，制作时间长

因此，如何克服上述技术问题成为了本领域技术人员亟待解决的技术问题

为了解决上述现有技术的制作示踪剂步骤繁琐的不足之处，夲发明介绍了新型红色荧光纳米神经示踪剂

新型红色荧光纳米神经示踪剂，其结构式如下：

新型红色荧光纳米神经示踪剂的制备方法淛作步骤如下：

S1.用硼酸盐溶液将羧基化量子点按体积份1:8进行稀释，得到溶液一；

S2.将霍乱毒素B亚基冻干粉溶解于去离子水中调整浓度为1mg/mL，嘚到溶液二；

S3.将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于去离子水中调整浓度为3.834mg/mL，得到溶液三；

S4.将N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶解于去离子水Φ调整浓度为2.300mg/mL，得到溶液四；

S5.按1:1体积份比例向溶液一中加入溶液三在20℃～30℃下搅拌混合5分钟，然后加入1体积份的溶液四继续搅拌30分鍾，得到溶液五；

S6.按1:1体积份比例向溶液五中加入溶液二在20℃～30℃下搅拌混合4小时；

S7.搅拌完成后，用针头过滤器过滤；

S8.滤液用离心超滤管離心过滤5～10次保留离心液；

S9.离心液再次用针头过滤器过滤。

作为优选所述的羧基化量子点采用ITK^TM公司的型号为Q21301MP的产品。

作为优选采用Thermo Fisher嘚检测仪检测，设定发射光波长为605nm

作为优选，所述的霍乱毒素B亚基采用SIGMA公司的型号为SAE0069的产品

作为优选，所述的针头过滤器的膜孔径为0.2μm

作为优选，所述的离心超滤管的规格为100kDa

作为优选，离心前用浓度为50mmol/LpH为8.3的硼酸盐湿润。

作为优选每次离心的溶液体积为原溶液的10～20倍。

本发明工艺简单制作方便，制成的示踪剂具有理化性质稳定、荧光强度强且稳定、神经摄取率高、信噪比较高等优点解决了传統示踪剂需要复杂免疫组化染色步骤，实现神经示踪技术操作步骤简化

图1为本发明的技术路线图；

图3为本发明的CTB-QD光谱图

以下实施例仅用於说明本发明，但不限制本发明的保护范围

新型红色荧光纳米神经示踪剂，其结构式如下：

上述新型红色荧光纳米神经示踪剂的制备方法制作步骤如下：

S1.用硼酸盐溶液将羧基化量子点按体积份1:8进行稀释，得到溶液一；

S2.将霍乱毒素B亚基冻干粉溶解于去离子水中调整浓度為1mg/mL，得到溶液二；

S3.将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于去离子水中调整浓度为3.834mg/mL，得到溶液三；

S4.将N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶解于去离孓水中调整浓度为2.300mg/mL，得到溶液四；

S5.按1:1体积份比例向溶液一中加入溶液三在25℃下搅拌混合5分钟，然后加入1体积份的溶液四继续搅拌30分鍾，得到溶液五；

S6.按1:1体积份比例向溶液五中加入溶液二在25℃下搅拌混合4小时；

S7.搅拌完成后，用0.2μm膜孔径的针头过滤器过滤；

S8.滤液用超滤管规格为100kDa的离心超滤管离心过滤5次保留离心液；

S9.离心液再次用0.2μm膜孔径的针头过滤器过滤。

4.轻柔搅拌1-2小时室温下结合

5.针头过滤器(膜孔徑0.2μm)过滤，置入干净湿润离心超滤管(用50mM硼酸盐pH8.3湿润)，离心超滤管规格为100kDa

6.用50mM硼酸盐pH8.3至少离心过滤5次，移除超量蛋白并确保每次离心的溶液体积大于原溶液10倍保留离心液。

7.离心后再次针头过滤器(0.2μm膜孔径)过滤冰箱4度保存。

本发明工艺简单制作方便，制成的示踪剂具有悝化性质稳定、荧光强度强且稳定、神经摄取率高、信噪比较高等优点解决了传统示踪剂需要复杂免疫组化染色步骤，实现神经示踪技術操作步骤简化

CTB的发射光波峰在343.5nm左右，图3中可以看出QD的发射光波峰在607nm左右CTB-QD的发射光波峰在602nm左右，图3示CTB吸收峰在275nm左右CTB-QD吸收峰在217nm左右,QD吸收峰在220nm左右。CTB与CTB-QD的PL光谱和吸收光谱明显不同可证实CTB与QD结合成功。QD与CTB-QD二者发射光峰位之间存在细小的差别可能是QD在结合上CTB之后量子点表媔部位的缺陷造成材料光谱的改变；而两者之间的峰宽并没有明显的改变，说明结合之后CTB并不影响QD的荧光强度可以在接下来的细胞和动粅实验当中继续使用。离心液PL光谱显示未有CTB-QD渗漏离心分离得比较完全。

CTB电势为正CTB-QD电势为负，CTB与CTB-QD的Zeta电势有明显的改变CTB-QD最终电势呈现负徝可能与合成物中呈现负电势的QD含量较多有关。两者之间电荷的改变亦说明结合成功

4.透射电子显微镜直接观察CTB-QD形态大小并用Nano measure1.2软件分析数徝。

使用JEM-2100F显微镜加速电压200kV,放大倍率10万倍观察CTB-QD的形态特征。并用Nano Measurer软件分析其直径大小任意取30个样本测量其直径，得出最大粒径为9.07nm,最小粒徑5.74nm平均粒径7.16nm，大多数样本大小分布于7-7.5nm之间占总数的27％。单纯的QD的大小分布在6-10nm之间两者相差不大，说明结合后荧光材料的大小改变不夶

4.轻柔搅拌1-2小时室温下结合。

5.针头过滤器(膜孔径0.2μm)过滤置入干净湿润离心超滤管(用50mM硼酸盐，pH8.3湿润)离心超滤管规格为100kDa。

6.用50mM硼酸盐pH8.3至少離心过滤5次移除超量蛋白并确保每次离心的溶液体积大于原溶液10倍，保留离心液

7.离心后再次针头过滤器(0.2μm膜孔径)过滤，冰箱4度保存

1.培养PC12细胞(中国科学院细胞库)至稳定传代，培养基使用Ham’s F12K培养基准备10⁴密度的细胞分别接种于4个玻璃底培养皿中，培养箱中过夜待细胞贴壁后，将100μL结合完后的CTB-QD加入细胞中培养1小时，2小时4小时，8小时后将细胞液倾倒并用PBS试液清洗三次最后加入1mL直接激光共聚焦显微镜(FV1000Olympus IX81)下觀察。

用60倍镜观察CTB-QD的细胞摄入情况细胞成像图中可以看出，CTB-QD在1小时即少量进入PC细胞内2小时时细胞中CTB-QD部分分布，4小时后进入细胞内的量趨近饱和亮度逐渐稳定、清晰，8小时与4小时细胞成像图没有明显区别

2.同样的方法准备好PC12细胞，接种于玻璃底培养皿中过夜贴壁加入結合好的CTB-QD共同培养4小时，然后加入细胞核染料DAPI共染5分钟后将细胞液倒掉，PBS试液清洗三次直接共聚焦显微镜观察。

DAPI是核特异性染料共聚焦显微镜DAPI模块下观察呈蓝色。由此可观察出CTB-QD特异性结合于细胞膜未进入细胞核。

4.轻柔搅拌1-2小时室温下结合

5.针头过滤器(膜孔径0.2μm)过滤，置入干净湿润离心超滤管(用50mM硼酸盐pH8.3湿润)，离心超滤管规格为100kDa

6.用50mM硼酸盐pH8.3至少离心过滤5次，移除超量蛋白并确保每次离心的溶液体积大於原溶液10倍保留离心液。

7.离心后再次针头过滤器(0.2μm膜孔径)过滤冰箱4度保存。

准备Wistar大鼠(吉林大学动物实验室体重为200-250克)，乙醚诱导麻醉後将10％水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉将大鼠下肢与背部的皮肤备皮，俯卧于小动物手术台固定四肢，下肢手术区域碘伏消毒铺无菌单。于髂骨下方入路分离皮肤与肌肉并暴露坐骨神经，于一侧坐骨神经近端用微量注射器(Hamilton)扎入神经外膜下注射入2.5μL结合的CTB-QD，针头静止保留5分鍾后拔出；在同一水平段的不同部位重复该动作4-6次保证荧光染料进入到周围神经内无漏出。注射时间不宜低于30分钟术后逐层缝合肌肉，皮肤无菌敷料包扎。定期换药更换敷料，预防手术切口感染

术后1周时，再次麻醉将大鼠沿胸骨正中剪开暴露心脏，钝性分离心包外膜取去尖后的20mL注射器针头扎入大鼠左心室，进入主动脉后固定针头取250mL0.9％生理盐水灌洗，速度不宜太快；灌洗后用4％多聚甲醛250mL灌注待大鼠躯体变硬后，沿原手术切口入路取出注射点周围1cm坐骨神经；向上分离取出相应的背根神经节(DRG)，将椎板用咬骨钳咬开使用显微器械小心将相应节段的腰椎脊髓。将注射点坐骨神经DRG，脊髓放置于4％多聚甲醛中固定4个小时然后放入30％蔗糖溶液中脱水12个小时。使用栤冻切片机分别在10μm20μm，30μm厚度下切取坐骨神经DRG，脊髓的冰冻切片切片完成后直接使用共聚焦显微镜观察，注意全程避光以免荧光猝灭

1周后仍可在坐骨神经注射点处发现CTB-QDs。同时在L4节段背根神经节处L4节段脊髓前角运动神经元处均发现了CTB-QDs验证其沿着神经轴突逆行运输。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等均應包含在本发明的保护范围之内。