复苏细胞时到底离心好还是及早换液好?(细胞复苏,细胞毒性) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 复苏细胞时到底离心好还是及早换液好?(细胞复苏,细胞毒性)
摘要: [复苏细胞时到底离心好还是及早换液好?(细胞复苏,细胞毒性)] 看到国内的多数参考书中都提到细胞复苏后应尽快去掉DMSO,是因为常温下的DMSO对细胞毒性很大,所以多采用离心的方法
但是国外的一些机构(如ATCC)和院校都不主张采用离心的方法, 认为离心对细胞的损伤远甚于残留DMSO的损伤(Centrifugation should not be performed to remove cells from the cryoprotectant cockta 关键词:[细胞复苏 细胞毒性]……
看到国内的多数参考书中都提到细胞复苏后应尽快去掉DMSO,是因为常温下的DMSO对细胞毒性很大,所以多采用离心的方法. 但是国外的一些机构(如ATCC)和院校都不主张采用离心的方法, 认为离心对细胞的损伤远甚于残留DMSO的损伤(Centrifugation should not be performed to remove cells from the cryoprotectant cocktail. This action is more damaging than the effects of DMSO residue in theculture.)这里想问问各位有经验的细胞高手,你们习惯采用哪种方法?或者实际对比过两种方法的优劣?因为我们最近购买了一株细胞挺贵的,看到参考书莫衷一是,拿不定主意?听听各位的意见.
回复以前我都的3-4小时后换液的，一般细胞生长的都还可以，上一次我做了一个离心对照：低速离心后，用生长液洗一遍，再放入预先准备好的。结果是后者的长得好，现在其他人也该用离心法 了。不过，我认为不管离心还是换液，重要的一步是刚从液氮拿出的时候动作一定要快，马上解冻，比较关键。回复依我的经验，离心好。第一次，没有离心，复苏的不错。第二次，细胞全死了，虽然后来想了一下，那一瓶DMSO量多，但由此可见，DMSO对细胞不好。所以，以后一直离心，没有任何问题出现。回复to be or not to be这是一个永远也无法回答的问题，因为没有人能够说清楚。究其原因是因为每个实验室常用的细胞不同，所用培养液不同，每个人的习惯不同，不能一概而论。其实这也是一个个人的经验而已。你自己认为可以就行了。我们实验室有的人就喜欢离心，有的人不喜欢。我就图简单，拿出来复苏后直接放到瓶子里第二天换液，如果挺好的就第三天换液，没什么。你要是觉得不离心好像不行，那你就离心不就完了么。有什么难的。回复用DMSO还是离心的好，为什么不用甘油，这样也就不用离心了，直接换液就行了回复我用DMSO冻存，复苏时从来不离心，等细胞贴壁后换液。看许多书上说，DMSO只对少数敏感细胞有毒性，我也就省事不离心了。细胞复苏长的很好！回复我们这里基本上复苏细胞也是不离心。回复那离心多长时间啊？转速多少呢？回复我们离心用的是1000rpm/min，跟收集细胞时的条件一样，另外我的经验是如果不离心的话可适量增加培养液的量，使DMSO的浓度降低，个人认为有用回复快速融化细胞，离心1000rpm/8min，我们冻存的时候用的是DMSO，我们养的是杂交瘤细胞，所以每次都需要离心，DMSO对细胞毒性太大，细胞太脆弱经不起毒性，楼上是不是有养贴壁细胞的
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细菌的离心转速至少是多少?为什么需要低温?
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离心机大小不同,转速一样,离心力的大小也不一样.所以要以g为主.一般来说,细菌对离心力不敏感,大一点小一点无所谓,只有在做感受态或者代谢实验等时候,才对离心速度有严格的要求.低温一般也是要求在做感受态和代谢实验等时候.温度低一些,细菌代谢就慢一些,对细胞本身也有一定的保护性.所以说,这个问题的回答时要看你做什么实验,这样才能回答~
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血清中可能出现的沉淀物是什么？
基于多年的实验研究，用于细胞培养的胎牛血清以及其它血清中可能会存在以下种类的沉淀物：
（1）纤维蛋白，它是经常出现的较大的沉淀物，可以达到1-2mm，可以用肉眼观察到。因为血清都是在低温下进行收集和快速处理的，一些纤维蛋白原（可溶性的形成絮状纤维蛋白的前体）在处理过程中仍然处于溶解状态，当经过最后的过滤分装后，就会在瓶中凝结出现纤维蛋白沉淀。
（2）磷酸钙，它也是常见的一种沉淀物，通常会使血清出现浑浊，并且在37℃培养的时候会增加。这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点，这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动，因此经常被误认为是微生物污染。
（3）胆固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白质。他们也是血清中出现沉淀物的常见原因。
血清中的沉淀物对细胞培养有什么影响？
（1）细胞生长，我们的试验以及经验表明沉淀物不会影响细胞培养，我们的客户以及其它血清生产商也证明了这一点。
（2）过滤，如果血清中出现大量的沉淀物，血清将很难过滤。一般说来，因为在血清生产时最后已经经过100nm或者40nm的过滤处理，并且经过了严格的无菌检测，因此不推荐再过滤用于细胞培养的血清。在实验室中没有必要再过滤处理血清，在大规模的细胞培养中往往将血清直接加到培养基中一起过滤。
（3）污染，磷酸钙往往被误认为微生物污染而引起争端。研究者可能会在血清中观察到一些絮状的沉淀，因此就会比较警觉的去做无菌试验，将血清放在培养箱中培养几天，结果可能会观察到更多的絮状沉淀，因此就断定血清被污染了。并且当研究者将血清样品放在倒置显微镜下观察时往往可以看到一些可以运动的小黑点，因此就更加确认是血清被污染了。于是，研究者就会花费更多的时间和精力来和生产商确认，但最终确定血清没有被污染而只是沉淀。为了避免这些问题的发生，我们建议不要直接将血清放在培养箱中培养观察是否有菌，而是将血清加到琼脂板上进行培养以观察是否有细菌生长。另外，也可以进行革兰氏染色，在油镜下观察，以确认是否有污染。
如何避免血清中沉淀物的出现？
首先要注意正确的血清解冻步骤，而且溶解过程中一定要每隔一段时间均匀而缓慢的摇动血清。我们已经发现在下列情况下沉淀物可能增加，使用中应该尽量避免：（1）热灭活血清；（2）在37℃下培养血清；（3）反复冻融；（4）&射线照射；（5）长期储存在2-8℃；（6）在室温下放置时间过长
如何去除血清中的沉淀？
如想去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装到无菌离心管中，以400g离心，上清液即可直接加入到培养基内一起过滤。注意：不要以过滤的方式去除这些絮状沉淀物，因为这可能阻塞滤膜。
冷冻管应如何解冻？
取出冷冻管后，须立即放入37°C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。
细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？
除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
一般客户拿到细胞后，应该注意什么？
客户收到细胞先不开盖，放在培养箱静置若干小时后（看细胞密度而定）在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议受收细胞时的培养基拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，显微镜下拍细胞100X，200X各一张），排除细胞本身污染的情况；收到细胞未开封，出现污染状况我们负责免费发送一株细胞。
收到细胞时如无异常情况，请在显微镜下观察细胞密度，如为贴壁细胞，未超过80%汇合度时，将培养瓶中培养液吸出，留下10ml培养液继续培养；超过80%汇合度时，请按细胞培养条件传代培养。如为悬浮细胞，吸出培养液、1000转/分钟离心2分钟，吸出上清，管底细胞用新鲜培养基悬浮细胞后移回培养瓶。
细胞消化液建议使用PBS配制，慎用Hanks液配制。
怎么样确定细胞的质量保障问题，能否开证明？能开什么样的证明？如果细胞出现问题，客户投诉，要求再发一株细胞，价格怎么算？
收到细胞48小时内，细胞出现活力状态问题（细胞活力状态用台盼蓝染色法鉴定细胞活力），我们受理投诉；超过48小时不超过一星期，我们收取第一次细胞全款的5折后，重新发放细胞。
快递细胞多久能到，是寄冻存的细胞还是复苏好的细胞？
我们采用快递发货，一般外地2--3天，寄细胞前请确认当地温度，如果气温低于4度的，则采用邮寄冻存细胞。
细胞出现问题，不予以重发的情况有哪些？
（1）客户造成细胞污染，不重发；
（2）客户不正确操作致细胞状态不好，不重发；
（3）非推荐细胞培养体系致的细胞状态不好，不重发；
（4）细胞状态不好，未提供细胞培养前3天照片的，不重发；
（5）细胞培养时经其它处理的，不重发；
（6）细胞收到2天内，未告知，不重发；
（7）视具体情况而定。
如何用台盼兰计数活细胞？
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/毫升，在0.1毫升的细胞悬液中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。
可否使用与原先培养条件不同之培养基？
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。
我们的细胞株所使用的培养液都是Gibco公司干粉配制的，均不含HEPES，所以我们建议您准备同样条件的培养液用于细胞培养。Hyclone的培养液请慎用，尤其是Hyclone液体原装培养液。
可否使用与原先培养条件不同之血清种类？
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
何谓FBS,FCS,CS,HS?
FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS(calfserum)则是指小牛血清。HS(horseserum)则是指马血清。
L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
培养细胞时应使用5%或10%CO2？或根本没有影响？
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7g时，细胞培养时应使用10%CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5g时，则应使用5CO2培养细胞。
何时须更换培养基？
视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
培养基中是否须添加抗生素？
除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。
附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？应如何处理？
一般使用之trypsin-EDTA浓度为0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20°C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。
悬浮性细胞应如何继代处理？
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。
欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？
欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg(约1000rpm)，5-10分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。
细胞之接种密度为何？
依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。
细胞冷冻培养基之成份为何？
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和90-95%原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。
DMSO之等级和无菌过滤之方式为何？
冷冻保存使用之DMSO等级，必须为Tissueculturegrade之DMSO(如SigmaD2650)，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4°C，避免反复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO之Nylon材质滤膜。
冷冻保存细胞之方法？
冷冻保存方法一:冷冻管置于4°C30-0分钟→(-20°C30分钟*)→-80°C16~18小时(或隔夜)→液氮槽vaporphase长期储存。冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3°C至–80°C以下，再放入液氮槽vaporphase长期储存。*-20°C不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
冷冻管内细胞数目一般为1x106cells/mlvial，融合瘤细胞则以5x106cells/mlvial为宜。
应如何避免细胞污染？
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
直接灭菌后丢弃之。
支原体(mycoplasma)污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？
不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。
支原体污染会对细胞培养有何影响？
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。
CO2培养箱之水盘如何保持清洁？
定期(至少每两周一次)以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
为何培养基保存于4°C冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？
培养基保存于4°C冰箱中，培养基内之CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenolred)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH值。
各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？
不同厂牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish或flask而有显著之生长差异。
购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？
研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建, 议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。
Hoechst 33258与Hoechst 33342都能染核，二者区别是什么？
Hoechst 33342，也称bisBenzimide H 33342或HOE 33342。分子式为C27H28N6O&3HCl&3H2O，分子量为615.99。Hoechst 33258，也称bisBenzimide H 33258或HOE 33258。分子式为C25H24N6O&3HCl，分子量为533.88。两种染料都是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。但是hoechst 33342对细胞的毒性作用更小一些，33258穿透能力较33342弱，染活细胞时容易被&泵出&，也就是拒染。所以一般来说hoechst 33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色。
收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？
冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。
购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于&80&C太久。
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【求助】细胞离心最大多少转速不会导致细胞破裂
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这个帖子发布于8年零163天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
以前都是做血浆内药物浓度测定，现在做的课题要测细胞内药物含量，是一般的肿瘤细胞，pbs冲洗细胞以后需要离心贴壁，离心在1.5mlEp管中进行，上次使用的是1000rpm离心十分钟，用移液枪转移上清的时候会有细胞悬浮起来，导致上清吸不干净。请问各位大侠，这种情况下，细胞离心保证不破裂细胞前提下最大可以用多少转速，多少时间啊？
不知道邀请谁？试试他们
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1.关于最大可以用多少转速，多少时间，你自己可以做一下实验2.1000rpm 离心十分钟可以离下来，关键是要小心操作，要不要十分钟你也可以试一下remove solution by gentle aspiration so that the cell pellet is not disturbed3.不知上清再离心一下是否可行，收集悬浮起来的细胞离心后和第一次的细胞加在一起感觉gentle aspiration是最佳方案
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Debio 1.关于最大可以用多少转速，多少时间，你自己可以做一下实验2.1000rpm 离心十分钟可以离下来，关键是要小心操作，要不要十分钟你也可以试一下remove solution by gentle aspiration so that the cell pellet is not disturbed3.不知上清再离心一下是否可行，收集悬浮起来的细胞离心后和第一次的细胞加在一起感觉gentle aspiration是最佳方案好的
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一般的肿瘤细胞，50mL离心管内是1000rpm,10分钟（4摄氏度）；但对于1.5mL离心管，一般用1100rpm，5分钟（4摄氏度）都可以离心下来了。如果是去除上清液，推荐是缓慢小心倒掉上清液，保持倒立位置，用干净小滤纸条吸干净壁上残余液体（注意不要碰到细胞团），然后再用食指或中指的正面（非指甲）将1.5mL离心管底部细胞弹起（此时底部残余液体为25~45uL左右，尽量让所有管残余体积一致），可转圈弹30次，注意用的力气是正好把细胞弹起，也不能用力太大，容易损伤细胞，并注意尽量不要引起气泡，有气泡时消除气泡（可垂直握紧离心管，用指甲垂直弹气泡处）。如此，可进行下一步的试验。
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关于丁香园细胞库 / 细胞培养
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离心转数清洗细胞
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问：我想分离平滑肌中的神经细胞，用1000转离心5分钟，共3次，得到的神经节特别少，是不是转数问题？ 答：我每次都是1000转8分钟，两次，效果还可以，不过也是越来越少。我认为不是细胞没有离心下来的原因，是本来细胞数量就少，我们肉眼所看到的越来越少，只是离心洗掉了很多杂质的成分，如一些膜的成分。答：每一次离心都会丢细胞,你可以延长离心时间减少细胞丢失。
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