用紫外-荧光微孔板酶检测技术测定两种土壤的酶活性--《四川农业大学学报》2012年02期
用紫外-荧光微孔板酶检测技术测定两种土壤的酶活性
【摘要】：【目的】土壤酶活性是土壤质量的重要指示指标,本文对土壤酶的快速检测方法进行了探讨。【方法】采用荧光微孔板酶检测技术,测定土壤硫酸酯酶、磷酸酶、β-葡萄糖苷酶和肽酶活性,采用紫外微孔板酶检测技术测定多酚氧化酶和过氧化物酶活性。【结果】结果表明,采自农田的赤红壤的硫酸酯酶、磷酸酶和肽酶活性高于紫色土和采自矿山的赤红壤的相应的酶活性;矿山赤红壤的多酚氧化酶和过氧化物酶活性在三者中最高;紫色土的β-葡萄糖苷酶活性高于赤红壤的β-葡萄糖苷酶活性。【结论】紫外-荧光微孔板酶检测技术可快速测定土壤中酶的活性。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：S154.2【正文快照】：
土壤酶是植物、动物、微生物活动的产物,它与土壤微生物共同推动土壤的代谢过程。由于土壤酶参与土壤中许多重要的生物化学反应过程,参与土壤中有机物质的分解转化,且与C、N、S、P等各元素的生物循环密切相关,因而常被作为评价土壤肥力的重要指标之一[1-4]。M.R.Banerjee等[5
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利用荧光微孔板快速检测释放的金属蛋白酶和相关的蛋白裂解酶活性
基质中的金属蛋白酶（ MMPs；例如，明胶酶，胶原酶，基质溶素）是胚胎发育、维持个体健康状态甚至肿瘤发生所必需的，它能够分解大量的胞外基质组件（1-4）。一般而言，释放出的金属蛋白酶在血管发生，伤口愈合，致命组织发育和癌细胞转移等过程中扮演了重要角色，因为它可以打破机体组织为入侵细胞的所设置的壁垒，还可以加快连续组织中的间质，弹性纤维，基膜（ECMs）的生理代谢。在机体发生炎症的情况下，由于机械压力，或者是由于遗传紊乱导致了基质中的金属蛋白酶的含量发生了较大的改变，并且金属蛋白酶的活性受到了大量抑制剂的调节，这类抑制剂一般被命名为金属蛋白酶的组织抑制子（TIMPs），由于这类抑制子的存在，使得金属蛋白酶和它们相关的TIMPs之间的平衡很大程度上影响了细胞调节。目前已经至少鉴定了20个金属蛋白酶，有关它们在细胞调节中的作用以及调节模式越来越成为一个新的研究热点。它们中的一些明显具有专一性特征，而其它的成员则表现出广泛的底物适配性。
目前快速分析金属蛋白酶的技术
金属蛋白酶活性可以使用不同的技术定量。其中广泛应用的一项技术是酶谱分析，这项技术是利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳制备那些胞外分泌的，或者是在细胞表面嵌合的蛋白酶。在复性后，利用考马斯亮蓝染色在胶上显示了清晰的条带。这种方法在鉴定蛋白复合物中的成分上有一定的优势，因为其基于一个蛋白复合物中不同蛋白的分子量和迁移率能够轻松鉴定出其中的金属蛋白酶。另一种鉴定金属蛋白酶的技术方法是利用金属蛋白酶专一性抗体，使用传统的免疫化学的方法能够对金属蛋白酶的水平进行定性和定量分析。而当利用 ELISA分析时，对一个金属蛋白酶的活性进行定量将更为便捷。但是如果要准确分析组织、细胞培养物、或者是血清样本中金属蛋白酶水平，往往还是要借助例如酶谱分析的方法。Molecular Probes，Inc提出了一套新的体外定量的实验策略，这一方法是利用荧光胶体耦连物，DQ明胶负载上过量的荧光素，从而使得荧光能够被淬灭。金属蛋白酶分解了大量的"荧光底物"，从而产生了能够发生荧光的多肽。荧光的增加与金属蛋白酶的水解酶的活性成正比，并且利用荧光微孔板上的荧光读取装置能够实时监控。通过这种方式使得利用荧光微孔板快速筛选大量的样本成为可能。事实上，这种方法与酶谱学方法相近，而不同于基于抗体的分析，因为Molecular Probes提供的这种荧光检测方法是依赖于金属蛋白酶的酶活检测。因此，这种酶活决定了金属蛋白酶是否能够被检测。在这次实验记录中，我们通过应用荧光微孔板读数（ Tecan Genios Plus ）,发现有可能对从培养的肿瘤细胞中释放的金属蛋白酶的量做出较为准确的检测。
我们利用两个细胞系， SK-UT-1（平滑肌肉瘤）和HT-1080（纤维肉瘤）培养在添加了10%FCS的DMEM中。我们用于荧光分析的实验流程是依照Molecular Probes, InC的方法。简而言之，在血清中用TNFα（10ng/ml）或者TPA（40nM）刺激细胞（大约2×10 6 /测试中），在37℃下超过20个小时。将这些细胞培养物的上清与1.5mM APMA混合。APMA是一种能够激活金属蛋白酶的化学试剂。继续离心浓缩样品体积小于100μL，将样品分别加在96孔板中，并且向其中补加激活缓冲液，以及该分析检测试剂盒中的荧光素耦连的凝胶。我们将稀释了不同浓度的胶原酶（Clustridium histolyticum）作为对照。微孔板在室温下温育，由于发应是连续的，因此读取不同时间点的荧光值。此时，酶谱分析平行进行，按照上面描述的方法处理培养物上清，然后在非变性的SDS-PAGE（8%）上电泳分离。电泳结束后，将凝胶置于溶液（ 2.5% TritonX-100 in 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 0.15 M NaCl, 10 mM CaCl 2 and 0.02% Brij 35 (w/v)）中温育，然后用考马斯亮蓝染色。随后脱色并用数码相机照相（Canon Power Shot 600）。
不同活力单位的细菌明胶酶的液化明胶酶活，在不同时间段的检测结果见 Fig.1。
这项测试证实了该试剂盒对于分析业经纯化的酶是高度灵敏的，因此利用这套试剂盒，能够便捷的检测组织或者细胞中抽提的 MMPs和重组产生的酶。检测的灵敏度能够达到低于0.001U/ml。当我们用它检测细胞培养物的上清，发现用APMA预处理是检测到金属蛋白酶活性必须的。这有可能是由于上清中的金属蛋白酶是一种蛋白酶原的形式。而用酶谱分析，考虑到它的液化明胶的能力，这个预处理步骤可以忽略，因为电泳本身以及SDS的存在，或许就能激活这种蛋白酶原形式。
Fig.2 显示的是经过TNFα或者TPA处理或者不通过它们处理，2×10 6 HT-1080经APMA激活的细胞上清的动态检测。上清酶活检测对应的荧光值反映了通过不同化学试剂刺激，细胞中释放的金属蛋白酶活性变化。经TNFα刺激后，释放的金属蛋白酶表现出高活性。
分别将 TNFα或TPA刺激后的上清做酶谱分析（Fig.3），两个样本的差别没有利用荧光分析反映的差别那么明显。酶谱分析显示，TPA 对MMP-9活性的刺激效果要比TNFα的明显。将酶谱和荧光检测结果进行对比，显示荧光分析首先探测到的或许是MMP-2。事实上，在同时所进行的酶谱分析中，MMP-2的水平与荧光检测的结果一致。在SK-UT-1中，金属蛋白酶的释放及酶活与上面的检测结果也极为类似。
用 Molecular Probes，Inc.荧光试剂盒定量分析金属蛋白酶，可以迅速和便捷地测量大量样品，因此用它可以快速检测出血清的细胞培养物，金属蛋白酶紊乱的病人的体液中是否有这种酶的存在。当然，这种检测方法本身不能区别金属蛋白酶家族的不同成员的活性，因此，至少在一定程度上需要酶谱，免疫分析，和更多的方法进行检测。应该指出的是，用APMA预处理细胞上清，测试中采用最少10 6 细胞数是这项检测最基本的条件。因此，为了更准确的分析它的蛋白裂解酶活性，酶谱分析是一个重要的补充手段。正像这里描述的，这种检测手段最大的优势，是利用了荧光技术，以及快速转移到微孔板上从而能够进行大规模准确分析。
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