干细胞向神经细胞分化的影响
背景与目的：　　microRNAs是一类高度保守的、非编码内源性小RNA分子，对机体正常的生长发育及疾病的发生发展起着重要的作用。Let-7家族成员对骨髓间充质干细胞（MSCs）的分化起着重要的作用，了解微小RNA let-7d对MSCs向神经细胞分化的影响可以促进颅内干细胞移植的发展。本文通过体外构建let-7d慢病毒载体并转染MSCs来探讨let-7d在MSCs向神经细胞分化过程中的作用。　　方法：　　1.构建大鼠慢病毒载体，分别为转染空白慢病毒、转染let-7d目的基因，转染抑制let-7d表达的目的基因，并用这些慢病毒载体转染大鼠MSCs；根据转染的慢病毒载体的不同，实...展开
背景与目的：　　microRNAs是一类高度保守的、非编码内源性小RNA分子，对机体正常的生长发育及疾病的发生发展起着重要的作用。Let-7家族成员对骨髓间充质干细胞（MSCs）的分化起着重要的作用，了解微小RNA let-7d对MSCs向神经细胞分化的影响可以促进颅内干细胞移植的发展。本文通过体外构建let-7d慢病毒载体并转染MSCs来探讨let-7d在MSCs向神经细胞分化过程中的作用。　　方法：　　1.构建大鼠慢病毒载体，分别为转染空白慢病毒、转染let-7d目的基因，转染抑制let-7d表达的目的基因，并用这些慢病毒载体转染大鼠MSCs；根据转染的慢病毒载体的不同，实验分为4个组：即转染上调组(转染let-7d-LV)、转染下调组(转染let-7d-inhibition-LV)、阴性对照组(转染空白慢病毒)、未转染组。　　2.MTT法检测转染后细胞的存活率。　　3.采用法舒地尔诱导转染后的各组MSCs促使其分化为神经细胞，　　4.以免疫细胞化学法检测分化后细胞表面NSE、MAP-2的表达变化，以确定MSCs已分化为神经细胞；　　5.应用RT-PCR、Western bolt法检测分化后神经细胞MAP-2 mRNA的表达量，以确定MSCs分化为神经细胞的效率；　　结果：　　1.在倒置荧光显微镜下观察到转染的MSCs有荧光显示，提示let-7d慢病毒载体转染成功。各组之间细胞的荧光强度无明显差异，提示不同组别之间细胞的转染效率无明显差异。　　2.MTT法检测细胞存活率，发现转染上调组、转染下调组及阴性转染组的细胞存活率之间无显著差异(P＞0.05)，但此三组细胞存活率均低于未转染组。　　3.在转染后的各组细胞之间加入法舒地尔，发现细胞形态发生变化，免疫细胞化学法发现高表达神经元标志物NSE、MAP-2，表明法舒地尔可以诱导MSCs向神经细胞分化。　　4.免疫细胞化学法发现转染上调组细胞的NSE、MAP-2的荧光强度高于阴性对照组和转染下调组(P＜0.05)，而转染下调组细胞的NSE、MAP-2的荧光强度低于阴性对照组和转染下调组(P＜0.05)。　　5.RT-PCR法检测MAP-2 mRNA表达量，发现转染上调组细胞的MAP-2表达量高于阴性对照组和转染下调组(P＜0.05)，而转染下调组细胞的MAP-2表达量低于阴性对照组和转染下调组(P＜0.05)。　　结论：　　1.let-7d慢病毒载体可以在体外转染大鼠MSCs，并且可以用于实验研究。　　2.let-7d可以促进MSCs向神经细胞的分化，通过控制let-7d的表达可以影响MSCs向神经细胞的分化效率。收起
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转染技术要点及转染试剂的选择
&&& 转染技术是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术，它是研究基因表达调控，突变分析等的常规工具。随着功能研究的兴起，其应用越来越广泛。以下就向大家介绍一些转染的技术要点及市面上主要的转染试剂类型的选择。&&& 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-96小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。&&& 转染效率收多种因素影响，主要因素有下面几个：1. 细胞培养物&&& 健康的细胞培养物是成功转染的基础。不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。低的细胞代数（&50）能确保基因型不变。高的转染效率需要一定的细胞密度，一般的转染试剂都会有专门的说明。推荐在转染前24小时分细胞，这将提供正常细胞代谢，增加对外源DNA摄入的可能。一定要避免细菌，支原体或真菌的污染。2. 血清大多数培养基在使用前需要加血清。胎牛血清（FCS）经常用到，便宜一点的有马或牛血清。通常的，血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响转染效率。因此在转染前建议先测(转右)试出对细胞生长良好的血清批号，转染时用同一批号的血清，并同时做负对照（不加转染试剂及外源DNA）以测试细胞生长是否正常。有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低，因此在转染前要除血清。但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡导致转染效率极低。3. 载体构建&&& 转染载体的构建（病毒载体，质粒DNA，RNA，PCR产物，寡核苷酸等）也影响转染结果。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞，此外还需考虑一些安全问题（如基因污染）。除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响，如前面提到的超螺旋及线性DNA对瞬时和稳定转染的影响。如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择组成或可调控，强度合适的启动子也很重要，同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰。4. DNA质量&&& DNA质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。核酸纯化世界第一品牌德国QIAGEN公司提供的超纯质粒抽提试剂盒，能达到两倍2x CsCl梯度离心以上的纯度效果，使您不必为DNA质量操心。此外，对一些内毒素敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），QIAGEN还提供可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保证理想的转染效果。5.转染技术&&& 转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下：转染方法 原理 应用 特点 && DEAE-右旋糖苷法
带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞 瞬时性转染 相对简便、结果可重复但对细胞有一定的毒副作用，转染时需除血清
磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞 稳定转染，瞬时性转染 不适用于原代细胞，操作简便但重复性差，有些细胞不适用。&& 电穿孔法
高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA通过膜上形成的小孔导入 稳定转染，瞬时性转染，所有细胞 适用性广但细胞致死率高，DNA和细胞用量大，需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件 阳离子性的脂质体法
带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞稳定转染瞬时性转染，所有细胞 适用性广，转染效率高，重复性好但转染时需除血清转染效果随细胞类型变化大 病毒介导法
逆转录病毒 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中稳定转染，特定宿主细胞 可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等，但携带基因不能太大细胞需处分裂期，需考虑安全因素 ，腺病毒 瞬时转染，特定宿主细胞 可用于难转染的细胞，需考虑安全因素。 Biolistic 颗粒传递法
将DNA用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，DNA在胞内逐步释放，表达瞬时性转染 可用于：人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴细胞系以及原代细胞 显微注射法
用显微操作将DNA直接注入靶细胞核 稳定转染，瞬时性转染 转染细胞数有限，多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞 。
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网站备案：苏ICP备号siRNA表达载体对SW480细胞原癌基因Pokemon的抑制 - 中国生物工程杂志
Vol 29, No.6
& 核心刊物 & 中国生物工程杂志
Vol 29, No.6 & siRNA表达载体对SW480细胞原癌基因Pokemon的抑制
siRNA表达载体对SW480细胞原癌基因Pokemon的抑制
郭睿 李喜霞 解军
山西医科大学生物化学与分子生物学教研室
Key Words：& RNA干扰
　Pokemon； SW480；　基因表达　
Pokemon；SW480；gene expression
观察siRNA表达载体对SW480细胞中Pokemon原癌基因的抑制效应，为进一步研究该基因的功能奠定基础。构建针对Pokemon基因的RNAi质粒表达载体，脂质体法转染人结直肠癌SW480细胞系，观察转染效率及细胞表型变化。稳定转染后，实时荧光定量PCR和Western blot检测SW480细胞中Pokemon mRNA及蛋白质水平的表达情况。镜下观察阳性转染率约36%，转染后细胞形态发生了显著变化，Pokemon mRNA及蛋白质的表达受到明显抑制。与阴性对照组相比，表达质粒产生的siRNA对Pokemon mRNA的抑制率达67.7%，对蛋白的抑制率达73.6%。构建的RNAi表达载体可以有效抑制SW480细胞中Pokemon基因的表达。
Abstract To investigate the inhibitory effects of siRNA expression vector on proto-oncogene Pokemon expression in SW480 cells and to provide experimental basis for further research about the biological function of Pokemon. siRNA expression vectors were constructed to express a short hairpin RNA to Pokemon. The recombinants were transfected into SW480 cells with liposome. Cellular morphology and transfection efficiency were observed. The expression of Pokemon were checked by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot. The transfection efficiency was about 36% and the cellular morphology changed greatly at 24h after transfection. siRNA expression vectors could specific reduce the expression of Pokemon mRNA and protein in SW480 cells. Compared with negative control, the inhibition ratio of Pokemon mRNA expression was 67.7% and the inhibition ratio of Pokemon protein was 73.6% respectively. siRNA expression vectors were successfully established that could effectively inhibit the expression of Pokemon in SW480 cells.
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