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白细胞检验
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【求助】抗凝静脉血提取白细胞
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这个帖子发布于5年零263天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我在检验科工作，最近做课题的需要，要从EDTA抗凝静脉血中先用低速离心机分离血浆，然后再从中分离白细胞将来准备提取DNA，曾经用蒸馏水破坏红细胞然后普通高速离心机分离出白细胞，但效果不好，怎么处理才能将细胞处理的更完美
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1、要想得到单个核细胞，就用淋巴细胞细胞分离液分离，效果非常好：在吸取血浆的全血球中加入等量的生理盐水后混匀加置非离液表面，1500转离心15分钟，唾吸取单个核细胞层的细胞悬液，用生理盐水洗一次即可。2、要想得到全部白细胞，就用氯化铵溶血法原理：NH4离子可以透过细胞膜进入，提高了红细胞的渗透压，导致细胞吸水、膨胀，最终破裂，造成溶血。方法：（1） 取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10 min。（2） 小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。（3） 在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15 min。（4） 2500rpm离心10 min，弃上清。（5） 加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15 min。（6） 3000rpm离心10 min，弃上清。（7） 倒置离心管，去掉残液。（8） 得白细胞，－80?C冻存。
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我现在从人外周血提中性粒细胞为什么总是有红细胞污染白细胞？这是我的实验步骤：取新鲜抗凝血2.5ml，与人中性粒细胞1：1混匀后加入15ml离心管中，以300转/分，离心15分钟，去上清液及所有的白颜色细胞层（但是我去的时候总是取到红细胞，据说白细胞是在红细胞上面薄薄的一层），弃去所有红细胞（这步还是上面说的，并不能把所有的红细胞都弃去，着急啊），然后将取得的上清液及所有的白颜色细胞层混匀液小心加于5ml分离液的液面上，以1800转/分离心15分钟，按理说，第一层为血浆或组织匀浆液层，第二层为环状乳白色细胞，第三层为浑浊分离液层（包含部分中性粒细胞）和中性粒细胞层，我收集了第三层，将其放入细胞洗涤液10ml的离心管中，充分吹匀后，2000转/分离心20分钟，后弃去洗涤液，留下管尖处的细胞（应该只有白色细胞，而我提出来的之前说过有红细胞污染，在我这里就是有红细胞和白细胞，而且红细胞的量大大的多于白细胞的量）在加入10ml洗涤液离心2000转/分钟，20分钟，后弃去洗涤液，加入5ml培养液，吹匀后，转入培养瓶中观察。唉，观察的全是红细胞啊，失败的不知各位大虾有什么高招没，给小的指点指点，千恩万谢啊
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检验烦人 我在检验科工作，最近做课题的需要，要从EDTA抗凝静脉血中先用低速离心机分离血浆，然后再从中分离白细胞将来准备提取DNA，曾经用蒸馏水破坏红细胞然后普通高速离心机分离出白细胞，但效果不好，怎么处理才能将细胞处理的更完美怎么能用蒸馏水呢？用它不但红细胞碎了，所有的白细胞都碎了。有专门的红细胞裂解液，用它就可以。如果你分析的对象是白细胞，那只能用这种方法，如果你的分析对象是不包括中性粒细胞的PBMC，则可以用Ficoll密度梯度离心法，效果较好。
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关于丁香园如何分离血小板及白细胞(白细胞,血小板,试剂) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 如何分离血小板及白细胞(白细胞,血小板,试剂)
摘要: [如何分离血小板及白细胞(白细胞,血小板,试剂)] 请教各位大虾：如何将血小板及白细胞进行分离制成血小板悬液及白细胞悬液？需要哪些试剂及到哪里购买？谢谢！ 关键词:[白细胞 血小板 试剂]……
请教各位大虾：如何将血小板及白细胞进行分离制成血小板悬液及白细胞悬液？需要哪些及到哪里购买？谢谢！
回复这位老兄,这项工作非常简单,请到你所在的城市血站去取就行了.如果想自己分离,去中心血站买一点分离液,这样比你自己去公司购买便宜多了.回复1、全血稀释后FICOLL离心，分为四层，血浆层，（白膜层） ，分离液层，粒细胞与红细胞层，由于粒细胞与红细胞的比重比较接近，二者均沉淀于分离液下，此步无法分开。2、把红细胞层以上的三层全部吸掉，剩下的细胞用生理盐水重悬，加入6％DEXTRAN T500至终浓度为0.6％，室温沉降30－40分钟。3、吸出上清，离心，沉淀用蒸馏水裂解去除红细胞，剩余的为颗粒白细胞回复1、全血稀释后FICOLL离心，分为四层，血浆层，（白膜层） ，分离液层，粒细胞与红细胞层，由于粒细胞与红细胞的比重比较接近，二者均沉淀于分离液下，此步无法分开。2、把红细胞层以上的三层全部吸掉，剩下的细胞用生理盐水重悬，加入6％DEXTRAN T500至终浓度为0.6％，室温沉降30－40分钟。3、吸出上清，离心，沉淀用蒸馏水裂解去除红细胞，剩余的为颗粒白细胞回复抗凝全血（EDTA或肝素）先采用低速离心，800 rpm 10分钟，取上清，即富血小板血浆（PRP), 余下的部分用PBS稍加稀释，采用FICOLL离心，取白膜层即为单个核细胞层，通常以淋巴细胞为主，少量单核细胞回复以上两位老兄说的FICOLL分离法只适用于单个核细胞分离,你说的白细胞是所有的白细胞,还是某一群细胞?血小板分离有专门的分离液回复谢谢各位仁兄的指导，我要的是所有的白细胞！回复我的实验步骤大概是这样的，取全血抗凝后分离出血浆、血小板和白细胞，然后将血小板和白细胞分别制成破碎液，请问宝车木又老兄能指导一下在下吗？我是个菜鸟，好多东西不懂！回复血小板极易被激活，目前最好采用密度梯度离心，分离效果比较好些。不知哪位朋友这方面有经验，可否指教一二呢 回复淋巴细胞分离液血小板分离有专门的分离液 有没有哪位朋友用过呢回复血小板的分离 方法I 一 试剂与器材1 ACD(1.5％枸橼酸，2.5％枸橼酸钠，2％葡萄糖)2 Sepharose 2B凝胶3血小板缓冲液(Glucose 5.5 mmol/L、Tris 15 mmol/L、NaCl 0.14 mmol/L，pH 7.4)二 操作步骤1 抽取20 ml血用ACD(1.5％枸橼酸，2.5％枸橼酸钠，2％葡萄糖)以6:1比例抗凝，立即混匀，待进行凝胶过滤分离血小板。2 血小板分离及凝胶过滤：ACD抗凝血于1 000 r/min离心10分钟，上清液为富血小板血浆(PRP)，PRP经Sepharose 2B凝胶过滤得静止血小板。3 用血小板缓冲液(Glucose 5.5 mmol/L、Tris 15 mmol/L、NaCl 0.14 mmol/L，pH 7.4)调血小板浓度为1×109/ml。方法II 一 试剂与器材试剂盒（上海太阳技术公司）1 抗凝液2 试剂A3 10×洗涤液4稀释液二 操作步骤1 将抗凝剂用50ml蒸馏水溶解。将试剂A用200ml蒸馏水溶解。将浓洗涤液与蒸馏水按1:9稀释。2 静脉取血，置于含有1/10体积抗凝液的中（0.5ml抗凝液＋4.5ml静脉血），800rpm离心15min，吸取上层液（富血小板血浆，PRP），置于另一中，3000rpm离心10min,弃去上层液，得血小板沉淀。3 加少量的试剂A至血小板沉淀中，用吸管将沉淀吹散后加入试剂A至2ml,静置10min，3000rpm离心10分钟，弃上清液。4 加少量的洗涤液至上述沉淀中，用吸管将沉淀吹散后加入洗涤液至5ml,3000rpm离心10分钟，重复四次，弃上清液，最后一次将试管倒置，沥干。5 加1ml的稀释液到上述沉淀中，用吸管将沉淀吹散后，进行血小板计数，加入稀释液调节血小板计数为2×106／ml。回复1.我认为最简便的方法是自然沉降，讲全血在室温静置一段时间以后红细胞白细胞会自然沉降下来，上层是富血小板血浆了。这样血小板也不容易发生激活和聚集。缺点是其中回函有少量的红细胞和白细胞。2.离心的过程却是可以使血小板发生活化和聚集，不知道您是要富血小板血浆做什么用处，建议你可以用一种CTAD抗凝管来采血，这种抗凝管也是蓝色的冒，但里面的抗凝剂出了枸橼酸钠之外，还有潘生丁、嘌呤和嘧啶，可以有效的抑制血小板的活化。但是如果你要是用这种血浆来做聚集试验的话，肯定不聚集。3.取富血小板血浆最好不要冷冻离心，因为在低温条件下，血小板会不稳定。22度离心是比较常用的，一般富血小板血浆的提取步骤就是抗凝全血在22度800rpm（或者100g）10-15min，上层就是富血小板血浆。回复1.我的实验需要富集的血小板，在利用全血分离血小板（二次离心法）过程中，容易激活血小板发生聚集，如何才能避免该状况发生呢？到底是二次离心法还是白膜回浆法好呢？2.另外我看文献有些是说用22度，而有些说用冷冻离心，到底哪种好呢？请各位赐教，谢谢！回复顶起来回复血小板是在22度条件下处理的。不能低温
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白细胞检验的基本方法
白细胞功能的检验
一、墨汁吞噬试验
掌握墨汁吞噬试验的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】
墨汁吞噬试验（ink
phagocytosis test）是依据血液中的中性粒细胞及单核细胞对细菌、异物等具有吞噬作用，在一定量的肝素抗凝血中，加入一定量的墨汁，经37℃温育4h，涂片染色后，在显微镜下观察吞噬细胞对墨汁的吞噬情况，并计算吞噬率及吞噬指数，从而协助急性白血病的诊断与鉴别。
试管、移液管、微量移液器、载玻片、37℃水浴箱、显微镜等。
（1）肝素：配成6U/ml水溶液。
（2）制备墨汁：于普通砚台上加生理盐水5ml，以优质中国块墨或印度墨，以100r/min研磨3min。所得墨汁经普通滤纸过滤3次备用。
（3）瑞氏染液等。
【方法步骤】
1．取小试管1支，加肝素20μl，加外周血100μl，混匀。
2．加入过滤墨汁10μl，混匀，加塞。
3．置37℃温育4h。
4．取温育后样本，推制成血涂片，干燥后，瑞氏染色。
5．油镜下观察计数幼稚细胞或中性成熟粒细胞100个；计数单核细胞20个。
6．判断结果&
根据细胞吞噬墨粒多少及大小，可定为下列程度：
阴性：细胞内未见吞噬墨粒。
阳性：(+)&
细胞内吞噬有小墨粒1～5个。
&&&&&&&&& (++)& 细胞内吞噬有大小不等墨粒10个左右。
&&&&&&&&& (+++)& 细胞内吞噬有大墨粒10个左右，小墨粒较多。
&&&&&&&&& (++++)&
细胞内吞噬有多数大颗墨粒，并有块状、球状，小墨粒很多，但细胞核清楚。
7．计算吞噬率及吞噬指数
吞噬率（%）=×100%
【注意事项】
肝素剂量对白细胞的吞噬功能有影响，肝素用量过大，细胞形态异常，吞噬率和吞噬指数降低；肝素用量过小，影响抗凝。以每100μl血用0.3U肝素为最适宜。
【参考范围】
成熟中性粒细胞吞噬率59～89%，吞噬指数66～186；
成熟单核细胞吞噬率90～100%，吞噬指数227～399。
【临床意义】
临床上可利用该试验了解吞噬细胞的吞噬功能，对白血病的诊断和分型有一定参考价值。粒细胞仅成熟阶段才具有吞噬功能，单核细胞幼稚阶段和成熟阶段均具有吞噬能力。AML-M5a为弱阳性，M5b吞噬指数明显增高。AML-M2、ALL和AML-M3吞噬试验均为阴性，AML-M4呈阳性反应。CML的成熟粒细胞吞噬能力明显降低。
二、白细胞吞噬功能试验
掌握白细胞吞噬功能试验的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】
白细胞吞噬功能试验（leukophagocytic
function test），是将待测的白细胞与葡萄球菌混合，37℃温育一定时间后，细菌可被中性粒细胞吞噬，涂片染色后，在显微镜下观察中性粒细胞吞噬细菌的情况，计数吞噬细菌的白细胞数以及被吞噬的细菌总数，计算吞噬率和吞噬指数，据此反映中性粒细胞的吞噬功能。
接种环、小试管、微量细胞培养板、水浴箱、载玻片、显微镜等。
（1）制备菌液：取在琼脂斜面上或平板上培养24h的白色葡萄球菌菌苔，用PBS（0.015mol/L
pH6.4）洗2次，沸水浴15～20min灭菌。将灭活菌液混悬于20%
FCS-RPMI1640培养液中，用比浊法调整细胞浓度至5×1010/L，置4℃备用。
（2）100U/ml肝素、甲醇、吉姆萨染液等。
【方法步骤】
1．于微量细胞培养板孔内（或小试管内）加100U/ml肝素1滴，无菌采集末梢血3滴，与孔内抗凝剂立即混匀。
2．向孔内（或小试管内）加白色葡萄球菌悬液3滴，混匀。
3．置有盖湿盒内，37℃温育30min，每10min轻摇一次。
4．用滴管取1滴培养液，推成薄片，甲醇固定，吉姆萨染色、干燥。
5．镜检计数&
油镜下观察计数200个中性粒细胞，记录吞噬细菌的细胞数，以及各个细胞吞噬的细菌总数，按下式计算吞噬率和吞噬指数。
吞噬率（%）=×100%
【注意事项】
1．所用器材要清洁。
抗凝剂用量应适当，过高会抑制吞噬功能，过低则易出现血液凝固。
要严格掌握吞噬的时间和条件。细菌与细胞比例以1∶1～10为宜。
涂片要薄，以便尽量减少因细菌重叠在细胞上而误以为吞噬的错误。
&& & 5．计数时应取载玻片前、中、后三段计数，以提高准确性。
6．本试验采用光学显微镜检查，分辨率不够高，有时难以准确计数吞入的细菌颗粒，应认真识别。
7．应根据各室的具体方法建立本室参考范围，以便客观地判定被测标本中性粒细胞的吞噬能力。
【参考范围】
吞噬率：健康人为61.4～64.2%。
吞噬指数：健康人为1.01～1.11。
【临床意义】
白细胞吞噬功能是其最重要的生物功能之一，本试验可作为判断机体白细胞功能状态，诊断白细胞本身所致疾病的参考。
1．吞噬率和吞噬指数增高，反映中性粒细胞吞噬异物功能的增强，常见于细菌性感染。
2．吞噬率和吞噬指数降低，见于机体免疫功能低下；营养、代谢、肿瘤等因素致白细胞分化不良或不成熟，如粒细胞性白血病，多发性骨髓瘤等；机体存在明显抑制白细胞的因素，如免疫抑制剂、抗白细胞抗体等。
三、血清溶菌酶活性试验
掌握血清溶菌酶活性试验的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】
血清溶菌酶活性试验（serum
lysozyme activity test），是利用溶菌酶能水解革兰氏阳性球菌细胞壁的乙酰氨基多糖成分，使细胞壁裂解，用对溶菌酶较敏感的微球菌悬液为作用底物，根据微球菌的溶解程度来检测血清或尿中溶菌酶的活性。
（一）平板打孔法
接种环、毛细滴管、无菌打孔器（孔径5mm左右）、水浴箱、测量尺等。
（1）等渗缓冲液(pH
6.4)：A液：磷酸二氢钾9.07g，氯化钠5.0g，溶于1
000ml蒸馏水中。B液：磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)23.87g，氯化钠5.0g，蒸馏水加至1000ml。A液、B液以10∶3比例混合，调至pH6.4。
（2）制备溶壁微球菌：
① 制备营养琼脂斜面培养基：取琼脂4.3g，加牛肉浸膏1.0g，蒸馏水100ml，浸10min后煮沸，使其完全溶解，倒入若干大试管，加塞，高压消毒15min，取倾向位室温冷却，置4℃冰箱保存，备用；
接种：溶壁微球菌在使用前于琼脂斜面培养基上传代一次，试验前按常规接种微球菌于斜面，置37℃培养24～48h，即可长出黄色菌落；③
制备细菌悬液：用无菌蒸馏水洗下菌苔，2000r/min离心30min，弃上清。再加蒸馏水轻轻混匀，2000r/min离心30min，弃上清，称沉淀物湿重，用无菌蒸馏水配成100g/L的浓菌液（菌液应在临用前配制，不宜存放过久），70～80℃加热灭菌，备用。
（3）1%琼脂：称琼脂粉1g，加入1/15mol/L
pH 6.4 PBS 100ml。
（4）溶菌酶标准液：取溶菌酶标准品，用1/15mol/L
pH 6.4 PBS制成5、25、100mg/L稀释液。
（5）被检血清。
【方法步骤】
1．制备溶壁微球菌琼脂平板&
取已配制好的菌液1ml，加到50～60℃已溶化的1%琼脂中，摇匀，倾注平板（直径7～9cm平板加1%琼脂15ml），待冷凝。
用打孔器在溶壁微球菌琼脂平板上打孔，孔间距18~20mm，用牙签挑去孔内琼脂。
用毛细滴管吸取血清，加入琼脂孔内。同时在另一孔内加满溶菌酶标准液作为阳性对照。
置25～30℃温育18～24h，观察结果。
5．制备标准曲线&
在每批测定同时，将各种浓度的溶菌酶标准液加入小孔中，同上法测定溶菌环的直径。在半对数纸上，以溶菌酶浓度为纵坐标（对数坐标），溶菌环直径为横坐标，绘制标准曲线。从曲线上查出每毫升待检品所含溶菌酶的微克数。
6．判断结果&
加血清孔和溶菌酶标准液孔周围的溶壁微球菌被溶解，可见圆形透亮区，即溶菌环。溶菌环的直径大小与溶菌酶的含量成正比。
【注意事项】
测量标准品与待检样品溶菌现象的间隔时间应尽量缩短，最好能在同一块板上备有标准品的对照，以便比较。
（二）比浊法
接种环、试管、721型分光光度计、水浴箱、微量移液器等。
（1）等渗缓冲液(pH
6.4)：同平板打孔法
（2）制备溶壁微球菌：同平板打孔法。将制备的菌液过滤，取上清液于分光光度计600nm波长处，以缓冲液调零，调节菌液浓度使其光密度为0.4，冰箱保存。
&（3）制备溶菌酶标准液：称取干燥溶菌酶2mg，用pH6.4的等渗缓冲液溶解，其酶浓度为lmg/ml(1000μg/ml)，储存液置冰箱保存，备用。溶菌酶应用液则取0.1ml溶菌酶储存液加4.9ml缓冲液，稀释50倍，其酶含量为20μg/ml。
【方法步骤】
&&& 1．将菌液置37℃水浴中预温2min。
2．抽取患者血液，分离血清，按表4-1进行操作。
溶菌酶测定步骤
加入物&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
管&&&&&&&&&&
菌液对照管&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&1&& &&&2& &&&&3& &&&&4&& &&&&&&5&&& &&&&&&&&6
微球菌液(m1)&&&&&&&&&&
3.0&&&&&&&&&
缓冲液（μ1）&&&&&&&&&
20&&&& 40&&&& 60&&&& 80&&&&&&& 100&&&&&&&&&
溶菌酶应用液(μ1)&&&&&&
80&&&& 60&&&& 40&&&& 20&&&&&&&
一&&&&&&&&&&
(每隔1min加入)
血清(μ1)&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
混匀，每管于37℃水浴中准确温育10min，取出即加反应终止液
5mol/L NaOH(ml)&&&&&& 0.05&&&
0.05&&& 0.05&&& 0.05&&&&& 0.05&&&&&&&
3．以缓冲液调零，600nm波长处比浊，检测各管的光密度。
5．制备标准曲线&
以测得各标准管的光密度为纵坐标，各标准管所含标准酶浓度为横坐标（第1管含酶16μg/ml，依次为12μg/ml，8μg/ml，4μg/ml），菌液对照管的光密度为零点，在坐标纸上画一曲线。
6．根据标准曲线查出被测血清样品所含溶菌酶的量。
【注意事项】
1．菌液4℃保存比较稳定。溶菌酶标准液以高浓度4℃保存为佳。
2．每批溶菌酶样品的测定须同时作标准管与菌液对照管的测定。
3．血清标本4℃保存10d，酶活性基本不变。
4．该法可同时用于测定尿中的溶菌酶活性，但要收集24h尿量，并加防腐剂，所得结果乘以尿量。
5．该法只适用于测定较窄浓度范围的溶菌酶，因此，测定前应先将待检样品的浓度作适当调整，使之适用于限定的测定范围。
6．细胞溶菌酶测定&
血和离心后的菌液各1滴，混合后制成涂片，置含湿纱布玻皿内，于37℃温育30min，干燥后瑞氏染色、镜检。细胞周围菌少，变细、变淡，并可见透明环为阳性。
【参考范围】
血清5～15mg/L；尿0～2mg/L。
【临床意义】
人体血清中的溶菌酶，主要来自血中的单核细胞和粒细胞，其中以单核细胞含量最多。在中性粒细胞中，从中幼粒到成熟粒细胞，其溶菌酶的含量可随细胞的成熟程度而增高。在嗜酸性粒细胞，除中幼阶段外，其余均无此酶。淋巴细胞中含量极低。血清和血浆中的溶菌酶大部分是由破碎的白细胞所释放。白血病患者血清溶菌酶含量的变化很大，与其细胞类型有密切关系。
主要见于急性髓细胞白血病：①AML-M5其血清溶菌酶含量明显增高，因外周血中成熟单核细胞增多导致溶菌酶释放增多所致，且增高程度与成熟单核细胞多少有关。尿溶菌酶含量也增高，故尿溶菌酶阴性可排除AML-M5的诊断。②AML-M4其血清溶菌酶含量也明显增高，其增高程度与白细胞总数有关。在治疗前其含量明显高，表示细胞分化程度较好，预后亦较好。③急性粒细胞白血病，其血清溶菌酶的含量可正常或增高，临床意义与急性粒-单细胞白血病相似。急粒和急单在治疗缓解，白细胞减少时，其含量也同时下降，但在复发时上升。
2．减低或正常&
①ALL其血清溶菌酶含量多数减低，少数正常；②CML其血清溶菌酶含量正常，但急变时下降。
四、硝基四氮唑蓝还原试验
掌握硝基四氮唑蓝还原试验的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】
硝基四氮唑蓝还原试验(nitroblue
tetrazolium reduction test)，是观察中性粒细胞对硝基四氮唑蓝(nitroblue
tetrazolium，NBT)还原作用的试验。NBT是一种染料，其水溶液呈淡黄色。当被吞入或渗入中性粒细胞后，有产生过氧化物酶的作用，并可接受己糖旁路代谢途径中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶作用产生的NADPH氧化脱下的氢，而被还原成非水溶性的蓝黑色甲月替（formazan）颗粒，并呈点状或斑块状颗粒沉淀于胞质内有酶活性的部位，可在显微镜下观察并计数阳性细胞百分比，借此反映中性粒细胞的杀菌功能。
&小试管、滴管、载玻片、水浴箱、显微镜等。
（1）0.15mol/L
pH7.2磷酸缓冲葡萄糖生理盐水(PBGS)：取0.15mol/L
Na2HPO4溶液7.6ml，0.15mol/L
KH2PO4溶液2.4ml及0.15mol/L
NaCl 10ml，混匀，加20mg葡萄糖，溶后过滤分装，8磅高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。
（2）NBT试剂：取NBT
l0mg，加入生理盐水5ml。室温振摇1h溶解(NBT难溶，亦可置80℃水浴中摇动或搅拌助溶)，滤去少数不溶性颗粒后，小量分装，此即贮存液，4℃可保存3～6个月。用时取需要量与等量PBGS混匀即为NBT试剂。
（3）肝素溶液：无防腐剂肝素注射液，用生理盐水稀释成1.25×105U/L。
（4）10g/L沙黄(safranin)水溶液：取沙黄1g，先加l～2ml
95%乙醇助溶，然后边振荡边加蒸馏水使之溶解成l00ml。滤纸过滤后，室温避光保存。
&（5）甲醇等。
【方法步骤】
1．取一小试管，加肝素溶液0.05ml，再加受检者外周静脉血0.5ml，混匀。
2．取抗凝血0.1ml与等量NBT试剂在小试管内混匀，盖住管口。置37℃温育25min，中间振摇1次，再置室温15min。
3．轻轻摇匀细胞，用滴管吸出1滴于载玻片上，推成涂片，立即吹干。甲醇固定2～3min，吹干。10g/L沙黄水溶液染色5min，水冲洗，待干。
4．镜检计数&
油镜下观察，凡中性粒细胞胞质内含有点状或斑块状深蓝色甲月替颗粒沉着者(只见一个典型颗粒也算)，即为NBT阳性细胞。计数100～200个中性粒细胞，算出NBT还原阳性细胞百分率。
【注意事项】
1．所用器材要清洁，避免玻璃表面因素增加NBT还原作用。
2．NBT试剂需用超细玻璃器过滤，不要残留颗粒；注意保存，不要被细菌污染。
3．孵育方式不同，会影响检出结果，在水浴内孵育的NBT还原阳性率会比在普通温箱中孵育者高。
4．涂片要推出头、体、尾，并厚薄适宜。太厚影响观察；太薄则细胞难找，计数费时。
5．单核细胞也可能还原NBT，应注意。聚集的或己破损的中性粒细胞，不可计数在内。
6．常有血小板粘附在中性粒细胞上，易与甲月替颗粒混淆，应仔细区别。
7．如无沙黄，也可用50g/L甲基绿染色15min代替；也可用瑞-吉染色，但切忌染液干涸在载玻片上。
【参考范围】
&正常成人的NBT阳性细胞数在10%以下。若有10%以上中性粒细胞能还原NBT，即为NBT还原试验阳性；低于10%则为阴性。
【临床意义】&
一般认为中性粒细胞在吞噬杀菌过程中，能量消耗骤增，己糖磷酸旁路代谢活性增强，还原NBT形成甲月替的能力也随之增强。故此试验可用于定性检测中性粒细胞产生O&2的能力，以间接判断中性粒细胞的杀菌能力。
1．用于中性粒细胞吞噬杀菌功能异常的筛选和辅助诊断&
NBT还原试验阴性见于儿童慢性肉芽肿(CGD)、G-6-PD缺乏症、家族性X染色体连锁致死性肉芽肿（FFG）、髓过氧化物酶缺乏症和Job氏综合征（高IgE、IgA）时。如在涂片中能查出几个出现甲月替沉淀的中性粒细胞即可排除CGD。如在涂片中未查出有甲沉月替淀的中性粒细胞，即为可疑CGD时，可作细菌内毒素激发试验确诊之。方法如下：将1g大肠杆菌内毒素溶于5ml生理盐水，取0.05ml与0.5ml肝素抗凝血(12.5U肝素/m1血)在试管内混匀，盖住管口置室温15min后，按前述方法进行NBT还原试验．若NBT还原阳性细胞超过29%，即可否定CGD；若仍在l0%以下，即可诊断为中性粒细胞吞噬杀菌功能异常。
2．鉴别细菌感染和病毒感染&
细菌感染时，中性粒细胞数量增多，粒细胞糖分解代谢活性增强，因此，全身性细菌感染时，患者的NBT还原阳性细胞通常在10%以上，而病毒感染或其他原因发热的患者则在10%以下。但若细菌感染而无内毒素等激发白细胞还原NBT的物质入血时，也可在10%以下。而病毒感染时常不增加或相对降低。
3．器官移植后发热的鉴别&
器官移植后发热，若非细菌感染所致，其NBT还原试验阴性；若该试验阳性，则提示可能有细菌感染。
4．无丙种球蛋白血症、镰状细胞病、恶性营养不良、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、糖尿病等，以及应用激素、细胞毒药物、保泰松等治疗时，NBT还原阳性细胞比例可降低。
5．新生儿、小儿成骨不全症、心肌梗死急性期，淋巴肉瘤，变应性血管炎、脓疮性银屑病、皮肌炎、某些寄生虫感染(如疟疾)、全身性真菌感染(如白色念珠菌性败血症)、注射伤寒菌苗后、口服避孕药或孕酮后，NBT还原阳性细胞比例可增高。
五、白细胞趋化试验
掌握白细胞趋化试验的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】&
白细胞趋化试验（white
blood cell chemotaxis test），是在趋化室微孔滤膜的一侧放入粒细胞，另一侧放入趋化因子（细菌毒素、补体C3a、小淋巴因子等），检测离体粒细胞潜过滤膜到达趋化因子这一侧定向移动的能力。
（1）趋化室：用有机玻璃自制，分上、下两室，上室直径5.5mm，下室直径5.5mm，深8mm的圆形孔室，有两条直径4.5mm的孔道与外界相通。趋化室上室用于放置白细胞悬液，下室置趋化因子，中间隔以合适的滤膜。
（2）滤膜：直径13mm，孔径3μm、5μm、8μm，厚150μm，混合纤维素酯滤膜。
（3）离心管、滴管、载玻片、显微镜等。
（1）趋化因子：健康人(或豚鼠)新鲜血清3～4份混合，分装后-20～-40℃冻存24h(可用大肠杆菌培养液、酵母多糖活化血清、淋巴细胞衍生趋化因子等)。
（2）白细胞悬液：在10ml离心管中依次加入下述A、B、C、D四种浓度梯度液各2ml：
① A液：90.0g/L
Ficoll 15.0ml加500.0g/L
Hypague 10ml，相对密度1.14；
② B液：90.0g/L
Ficoll 17.5ml加500.0g/L
Hypague 10ml，相对密度1.13；③
90.0g/L& Ficoll 20.0ml加500.0g/L
Hypague 10ml, 相对密度1.12；④
D液：90.g/L
Ficoll 24.0ml加339.0g/L
Hypague 10ml，相对密度1.08。在D液上层加入用生理盐水1∶2稀释的受检者肝素抗凝血(10U/ml)2ml，1000r/min离心40min，在血浆与D液界面为单个核细胞，C、B界面为中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，B、A界面为嗜酸性粒细胞。
&（3）甲醇、苏木素染液、乙醇等。
【方法步骤】（膜滤法）
1．将趋化因子0.5m1(用培养基作阴性对照)自外侧孔注入趋化室下室，封闭孔道，上室加入白细胞悬液0.3ml，37℃培养2h。
2．取出滤膜，甲醇固定后，在苏木素染液中染色15min，用蒸馏水冲洗。乙醇脱色。
3．再依次在70%、90%、100%的乙醇(或异丙醇)中脱水，每种浓度中各脱水3～5min。
4．将滤膜贴于载玻片上，封片。
5．镜检计数&
油镜下观察滤膜。原来向上的一面为淋巴细胞与单核细胞，原来向下的一面只含移动过来的中性粒细胞(用孔径3μm的滤膜)，观察时应调节镜头焦距，计算5个高倍视野中中性粒细胞数(约250个)。阴性对照观察20~30个视野。通常以双份滤膜内移动细胞的平均数为趋化单位。
【注意事项】
&&& 1．测定白细胞趋化功能时，应作预实验以选择最适白细胞浓度、最适趋化因子浓度。
2．注意固定采用一种计数方法，即滤膜下表面计数法或滤膜内计数法。
3．滤膜的质量、厚度、孔的大小都能对趋化功能产生较大的影响，因此应使用统一滤膜。
4．各实验室应建立自己方法的参考范围。
【参考范围】&
趋化指数3.0～3.5。
【临床意义】&
趋化性是粒细胞在趋化因子的作用下到达炎症局部所必需的功能。趋化因子的量增多，细胞趋化移动加快。
1．趋化指数增高&
主要见于细菌感染，其趋化指数常迅速增高。病毒感染，尤其是感染的早期，趋化指数常在正常范围内，故该试验在鉴别不明原因的感染中有参考价值。
2．趋化功能减低&
主要见于：迟钝白细胞综合征（lazy-leukocyte
syndrome）、Wiskot-Aldrich综合征、幼年型牙周炎、糖尿病、尿毒症、烧伤、新生儿、慢性皮肤粘膜白色念珠菌病、高IgE综合征、先天性鱼鳞病、膜糖蛋白(相对分子量ll
kDa)缺陷症、肌动蛋白功能不全症、Chediak-Higashi综合征。当趋化因子生成不足或其抑制因子过多时也可出现趋化功能异常。
六、吞噬细胞吞噬功能试验
掌握吞噬细胞吞噬功能试验的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】
吞噬细胞吞噬功能试验（phagocyte
phagocytic function test
），是检测吞噬细胞吞噬功能的方法之一。活体巨噬细胞、单核细胞在体内外均有很强的吞噬细菌、异物的功能。在体外将吞噬细胞与异体细胞或细菌混合孵育后，染色观测其吞噬异体细胞或细菌的数量，可了解其吞噬功能。利用中药斑蝥在人的前臂皮肤上发疱，造成非感染性炎症，诱使单核细胞游出血管大量聚集于疱液内，抽取疱液即为天然提纯的吞噬细胞悬液。以鸡红细胞（CRBC）为靶细胞，经体外37℃温育后，涂片染色，显微镜下观察吞噬细胞对鸡红细胞的吞噬消化活性，并计算吞噬率和吞噬指数，以判断吞噬细胞的吞噬功能。
眼科镊子、长镊子、滤纸、盖玻片、37℃水浴箱、离心机、载玻片、显微镜等。
（1）10%的斑蝥酊剂：斑蝥10g，95%乙醇90ml，浸泡2周以上。
（2）5%鸡红细胞悬液。
（3）Aisever保存液：取葡萄糖2g、枸橼酸钠0.8
g、枸橼酸0.055g、氯化钠0.42g，加入蒸馏水100ml。配成后68.95kPa，10min消毒。
（4）生理盐水。
（5）吉姆萨染液。
（6）甲醇等。
【方法步骤】
1．制备皮疱液
（1）先用眼科镊子取lcm2大小的滤纸2张，蘸上10%斑蝥乙醇浸出液，贴敷在前臂屈侧皮肤上，在滤纸下压一块血细胞计数板盖玻片，上面再敷以消毒纱布，用橡皮膏固定之。
（2）4～5h后，将滤纸、盖玻片和纱布一并取下换上一个拱形塑料盖，以防止开始形成的水疱破裂。
（3）48h后，在前臂皮肤上可形成一个同盖玻片一样大小的水疱，用无菌注射器或三棱针小心将皮疱液全部挤出。最后，局部涂以消炎药膏，以无菌纱布敷盖。
2．制备5%鸡红细胞（CRBC）悬液
（1）自鸡的一侧翅翼下静脉取血，将鸡血加到置有Alsever液的消毒青霉素瓶中，充分混匀。血与Alsever液的比例为1∶5。放4℃冰箱可保存半个月。
（2）临用前用生理盐水洗涤鸡红细胞3次，头2次离心为1500r/min离心3min，第3次2000r/min离心5min，按红细胞压积用生理盐水配成5%的鸡红细胞悬液。
3．吞噬细胞吞噬功能检测
（1）斑蝥刺激皮疱液lml，加5%的鸡红细胞悬液0.04ml，置硅化离心管中混匀，置37℃温育30min，每10min轻轻摇动一次。
（2）1000r/min离心l0min，弃上清。
（3）取沉淀细胞涂片，干后用甲醇固定，吉姆萨染色(吉姆萨染液用缓冲液作1∶4稀释)。
（4）镜检计数：油镜下观察吞噬细胞吞噬消化鸡红细胞的情况，并至少计数200个吞噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数。
吞噬率（%）=×100%
【注意事项】
1．斑蝥浸液对皮肤有刺激作用，其用量应适当、恒定。用量过多，反应过强，48h后皮疱液内中性粒细胞较多，使用适当，才可获大量的巨噬细胞。
2．取皮疱液时，应严格无菌操作，并尽可能吸净皮疱液，如不易抽出，可从不同角度抽吸，因残留的皮疱液易导致继发感染。
3．若皮疱液中蛋白过高，易凝固，可在试管内加入适量抗凝剂。
4．皮疱液不能立即检查时，可置4℃冰箱放置2～4h，对巨噬细胞形态和功能无影响。
5．最好设正常对照，便于判断结果的可靠性。
6．必须掌握好吞噬作用时间，时间过长被吞噬的鸡红细胞可被消化，时间过短则未被吞噬。
7．涂片的厚薄应适宜，太厚影响观察；太薄则细胞难找，计数费时。
8．通常应计数200~500个细胞。计数少，影响结果的可靠性。
【参考范围】&
吞噬率： 61.39～64.15%；吞噬指数：1.009～1.107。
【临床意义】&
吞噬细胞是机体单核吞噬系统的重要组成部分，其在组织中含量多，分布广，移动力强且能识别肿瘤细胞，在机体免疫监视系统中发挥主要作用。本试验可测定吞噬细胞的非特异性吞噬功能，在吞噬细胞功能检测的基础理论研究和临床治疗方面都有重要意义。
1．巨噬细胞吞噬功能低下，主要见于各种恶性肿瘤，如食道癌、胃癌、肠癌、宫颈癌等，其吞噬率常低于45%，肿瘤消除后可以上升，故可作为肿瘤病人手术、化疗、放疗及免疫治疗疗效观察的参考指标。
2．一些免疫功能低下的病人，吞噬率降低，可作为预测感染发生的概率、观察疗效及判断预后的指标。
白细胞代谢及其产物检验
一、末端脱氧核苷酰转移酶检测
掌握末端脱氧核苷酰转移酶检测的原理、方法、注意事项和临床意义。
（一）酶免疫组织化学检测
【实验原理】
酶免疫组织化学检测（enzyme
immunohistochemistry assay）是利用一种DNA聚合酶，即末端脱氧核糖核酸转移酶(terminal
deoxynucleotidyl transferase, TdT)，直接催化细胞的脱氧核苷酸，使其转移到低聚核苷酸或多聚核苷酸的3-OH端，合成单链DNA。兔抗牛TdT抗体能和人细胞的TdT产生交叉反应，可采用免疫荧光技术或酶标免疫细胞化学技术，用辣根过氧化物酶-抗酶复合物在细胞涂片上定位，显示细胞内的TdT。
离心管、载玻片、微量移液器、滴管、37℃水浴箱、离心机、显微镜等。
（1）淋巴细胞分离液（相对比密为1.077）。
（2）过氧化氢-甲醇固定液：甲醇液中含H2O2浓度为0.03%(V/V)，4℃冰箱保存。
（3）0.1mol/L磷酸盐缓冲掖(pH7.2)。
（4）正常兔血清lgG。
（5）兔抗牛TdT抗体（作1:8稀释）。
（6）羊抗兔IgG（作1:10稀释）。
（7）PAP免疫复合物（作1:20稀释）。
（8）二氨基联苯胺(3,3-diaminobenzidine,DAB)溶液：0.05mol/L
Tris-HCl-9g/L NaCl液(pH7.4)l00ml，含过氧化氢(V/V)0.03%，4℃冰箱保存，用前加入30mg
DAB，溶解后过滤，立即避光使用。
【方法步骤】
1．用淋巴细胞分离液分离新鲜抗凝血，取淋巴细胞层细胞离心涂片或直接涂片、待干。
2．将涂片用过氧化氢-甲醇液于4℃固定20~30min。
3．将涂片置0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡15min。
4．滴加兔抗牛TdT抗体，置37℃湿盒内温育30min。用0.1mol/L
PBS冲洗2次。
5．滴加羊抗兔lgG抗体，置37℃湿盒内温育30min。用0.1mol/L
PBS冲洗2次。
6．滴加PAP免疫复合物，置37℃湿盒内温育30min。用0.lmol/L
PBS冲洗2次。
7．加入DAB溶液显色，室温避光作用5～10min。水洗5min，干后镜检。也可用哈氏苏木素液复染胞核10min后再行镜检。
【注意事项】
1．标本必须新鲜，以保证待测抗原活性。
2．抗体、PAP复合物和封闭血液不可反复冻融，应放4℃保存。
3．一抗、二抗和PAP复合物的温育必须在湿盒内进行。加抗体和PAP复合物加样量应以足以盖过血膜为宜。在温育过程中切忌液体干涸和分布不均匀。
4．去除内源性过氧化物酶所用的H2O2浓度宜为3%～4%，浓度过高会影响细胞抗原和细胞形态的完整性。
5．若用几种抗体同时检测不同的抗原，在第一抗体温育和漂洗过程中，要避免交叉污染。
6．双PAP法的重复标记可提高对微弱抗原的检出率，但以重复2次为宜，否则会增加非特异性着色和背景污染。
【判断结果】&
阳性反应为棕黄色颗粒，定位在细胞核上。TdT为早期T淋巴细胞的标志，在正常情况下不成熟的胸腺淋巴细胞出现阳性反应。
【临床意义】&
95%以上ALL和大约30%慢粒急淋变患者外周血细胞呈阳性反应，病情缓解后阳性率逐渐减弱。在ALL中，由于细胞表面标志不同，TdT活性也有变化，T-ALL，non-T-ALL，non-B-ALL细胞的阳性率很高。B-ALL细胞阴性。当外周血中此酶活性升高，预示血细胞的恶性变。因此TdT的测定对急性白血病的鉴别和治疗监测有一定意义。
&（二）放射性同位素检测
【实验原理】&
以3H或14C标记的脱氧腺苷三磷酸等的dXTP为基质，用低聚脱氧核苷(dA)等人工同聚物作为引物，由于酶反应与引物重合，使基质不溶于三氯醋酸，可用玻璃纤维盘将其吸附，从未被放射性同位素标记的反应基质中分离出反应的生成物，并测定其放射活性。扣除不加引物所测定的内源性反应所引起的放射活性之后，可测算酶的活性。
试管、微量移液器、超速离心机、超声波细胞破碎机、液体闪烁
计数器等。
（1）淋巴细胞分离液（相对比密为1.077）。
（2）3H或14C标记的脱氧腺苷三磷酸等。
（3）脱氧腺苷三磷酸。
（4）多聚脱氧腺苷或低聚脱氧核苷(dA)。
（5）二硫苏糖醇(DTT)。
（6）苯甲基磺酰氟化物(PMSF)。
（7）TritonX-HCl（pH7.5）。
（8）Whatman
GF/C玻璃纤维盘。
（9）吡咯啉酸。
（10）乙醇。
（11）乙醚。
（12）甲苯系列闪烁液。
（13）蔗糖-TKM缓冲液：250mmol/L蔗糖，50mmol/L三氯醋酸(TCA)pH7.4，25mmol/L氯化钾，5mmol/L氯化镁，5mmol/L
DTT，lmmol/L
PMSF，5ml/L
TritonX-100。
【方法步骤】
1．用蔗糖-TKM缓冲液提取末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，用d（PA）12～18测定TdT活性。
（1）提取粗酶液：在蔗糖-TKM中，加入经淋巴细胞分离液分离的白血病细胞(末梢血或骨髓血)，使成1×1011个细胞/L的悬液，放在干冰-丙酮中，使之急剧冻融5次，将细胞破坏，或用安装有微尖型探针的超声波细胞破碎机，使细胞破坏后，在冰浴中振荡15min，提取TdT，超速离心(70000r/min，60min)。取上清液作为粗酶液。
（2）测定TdT活性：取粗酶液50μl与测定TdT的基质液[50mmoI/L
Tris-HCl pH7.5，30mmol/L氯化钾，0.5mmol/L
DTT，5mmol/L
dGTP (含有poly
DT 0.05U，3H-dGTP37kBq)各50μl]混合，37℃温育20min后，置冰浴中使反应停止。将一部分涂在
Whatman GF/C玻璃纤维盘上。立即将此盘放入冰冷的60mmoI/L
TCA+0.05mol/L吡咯啉酸液中，振荡15min，洗盘，再用30mmol/L
TCA+0.025mol/L吡咯啉酸，冲洗2次，分别用乙醇及乙醚洗净，使盘干燥。把干燥的盘放入液体闪烁计数器用的小玻瓶中，加甲苯系列的闪烁液，使吸附在玻璃纤维盘上的反应生成物具有放射活性，再用液体闪烁计数器测定[通常以mmol
dGTP掺入1×108个细胞来表示TdT活性，或用U/1×108细胞表示(1U等于60min内有lnmol的dGTP)]。
2．用0.25mol/L磷酸钾(pH7.5)提取TdT，用d（PA）40~60测定TdT活性，用含
lmmol/L 2-巯基乙醇(2-ME)的0.25mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)，在缓冲液中细胞以1×1011/L左右的浓度悬浮，用超声波破坏细胞(4次/15秒)，将其超速离心(70000r/min，60min)，所得上清液即是测定TdT活性的粗酶液。
【注意事项】
1．当测定ALL的幼稚细胞等有极高活性的标本时，即使使用粗酶液也能满意地检出其活性。当测定TdT活性低的标本时，由于在粗酶液中包含有蛋白酶，可能对TdT产生影响。此外，核酸酶的引物、反应生成物及某些抑制物及内源性引物等，均可能影响检测结果。用磷酸纤维素柱及蔗糖密度梯度离心沉淀法沉淀，用部分酶提纯进行测定时，可使这些问题在某种程度上得到解决。
2．为了从细胞中充分提取TdT，必须使用0.25mol/L的磷酸钾缓冲液，因为高浓度的盐可抑制TdT的活性。测定时应将提取液稀释5倍以上。为使粗酶液的盐浓度下降而进行透析时，会导致TdT失活。
3．本试验使用放射性试剂，试验的整个过程应避免放射性污染。
【参考范围】
健康人骨髓细胞的活性为dGTP掺入1×108个细胞的量为0～0.09mmol/L。
【临床意义】
1．ALL(T、B、非B型)可检出较高的TdT活性，CML急性变时，约有1/3的病例在原始细胞中能检出高的TdT活性。
2．恶性淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤的淋巴结细胞中可检出较高的TdT活性。
3．TdT检测在研究造血细胞的分化与白血病的关系、白血病细胞的起源、白血病的治疗药物选择上都有重要的价值。
二、N-碱性磷酸酯酶检测
【目的】掌握N-碱性磷酸酯酶检测的原理、方法、注意事项和临床意义。
【原理】N-碱性磷酸酯酶检测（N-alkaline
phosphatase assay）的原理是用P-硝基酚磷酸盐(P-NPP)作为细胞碱性磷酸酯酶(APase)总活性检测的基质，在反应中生成P-硝基酚，测量400nm时的光密度，借以检测细胞N-APase的总活性。此外，可通过巯基乙胺-S-磷酸盐（CASP）作为基质来测定N-Apase的活性。通过酶反应，生成半胱胺，用二硝基苯(DNTB)置换5-硫-硝基酚酸；测定412nm的吸光度，借以检测N-APase的总活性。在基质液中加入用N-丁醇∶水为1∶3的混合液提取的粗酶液，室温下放置60min，记录酶反应，求出酶反应的速度。一般情况下，N-APase的P-NPP与CASP的水解速度之比(VP-NPP/VCASP)在1.1～2.0的范围内，平均为1.8。因此，N-APase的活性可用VP-NPP-1.8
VCASP求出，再从(VP-NPP-1.8
VCASP)/VP-NPP计算N-APase的百分率。
试管、蒸馏设备、微量移液器、加热设备、超速离心机、721型分光光度计等。
（1）P-NPP。
（2）三氯化磷(PCl3)。
（3）无水氯化铝。
（4）硫磺粉末。
（5）氢氧化钠。
（6）2-氨乙基氢溴化物。
（7）N，N-二甲基甲酰胺。
（8）甲醇。
（9）乙醇。
【方法步骤】
1．制备巯基乙氨-S-磷酸盐（CASP）
(1) 制备三氯硫化磷(PSCl3)：用蒸馏设备，加三氯化磷54.6ml，硫磺粉20.1g，加热至40~50℃，使之反应。将反应物三氯化磷用120～125℃蒸馏收集。蒸馏过程中必须注意反应物不能受潮。
制备单纯磷酸三钠：氢氧化钠40g溶于水300ml中，加三氯化磷17.5ml，用蒸馏水设备加热至110～115℃，15min以上，直到三氯硫化磷层消失为止。用冰水将其冷却，用单硫磷酸三钠与氯化钠分层，过滤后收集，溶于40~45℃水中，在上述溶液l00ml中，加无水甲醇185ml，使析出的单硫磷酸三钠沉淀。反复进行此项操作后，加无水甲醇
200ml，搅拌1h，使之脱水，过滤。于100℃放置1h，使之干燥，密封保存在容器中。
(3) 制备氢化巯基乙胺-S-磷酸钠：硫代磷酸三钠9.0g溶于蒸馏水50ml中，然后加2-氨乙基氢溴化物10.9g与N，N-二甲基酰胺25ml。充分搅拌40h。直至析出白色结晶，加乙醇300ml，使其在无水甲醇200ml中搅拌1h，得到结晶，在无水条件下真空干燥。
2．N-APase的测定
(1)粗酶液的调配：检测正常人粒细胞、淋巴细胞、白血病细胞或白血病细胞株培养的细胞时，取106～108细胞，使之在0.1mol/L
Tris-盐酸溶液(pH8.0)lml中悬浮匀浆后超速离心(70000r/min，30min)，保留上清液。另用n-丁醇∶蒸馏水(0.3∶1)提取小团块，亦即在有小团块的水溶液中，加n-丁醇，每5min用涡式混合器充分搅拌一次，边加丁醇边搅拌，共3次。超速离心(70000r/min，30min)，取上清。用这两种上清液测定N-Apase恬性。
(2)测定N-APase活性：①用基质P-NPP测定：在含有作为基质的1.0mmol/L
P- NPP的0.5mol/L
Tris-盐酸缓冲液(pH9.0)的基质液中，加酶液100μl，室温下进行酶反应60min。由于P-NPP水解，记录400nm吸光度的变化，从直线部分计算反应速度；②用基质CASP测定：在lmmol/L
CASP，0.5mmol/L
DNTB的0.5mmol/L
Tris-盐酸溶液(pH9.0)的基质中，加酶液100μ1，室温下放置60min。由于酶反应，生成半胱胺，通过DNTB变换为5-硫-硝基酚酸，测定并记录412nm处的吸光度，从直线部分计算反应速度。
N-APase的活性可按前述VP-NPP-1.8VCASP计算求出百分率。
【注意事项】&
1．CASP尚无商品出售，须自行提纯，而该方法颇为复杂，且CASP的纯度
对N-APase的活性有影响。
2．因硫代磷酸三钠及正磷酸盐混入可抑制酶反应，因此制备CASP时，务
必将杂质完全除去。
3．以CASP作为基质进行测定时，应在比色杯上加盖，以防止生成的半胱
胺发生氧化反应。
【参考范围】
健康人粒细胞、淋巴细胞中不能检出N-APase的活性。
【临床意义】
本试验可用来检测未成熟淋巴细胞的标志。在AML及CML的慢性期、CML急粒变的原始粒细胞中，均不能检出N-APase。但在ALL和CML急淋变的原始淋巴细胞中能检出N-APase，且不仅在非T、非B-ALL的幼稚细胞，就是在T-ALL及具有B细胞标记物的原始细胞中亦可检出。因此认为此酶是从未成熟的白血病性原始淋巴细胞向T细胞、B细胞分化过程中未成熟的淋巴系统的细胞标志酶。此外，在鼻咽癌、喉癌的肿瘤细胞中，以及与EB病毒有关的传染性单核细胞增多症、Burkitt淋巴瘤等，都可检出此酶。
三、酸性α-醋酸酯酶检测
掌握血细胞酸性α-醋酸酯酶检测的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】
酸性α-醋酸酯酶检测(α-acid
naphthyl acetate esterase assay)，
是利用血细胞中的酸性α-醋酸萘酚酯酶(α-acid
naphthyl acetate esterase，ANAE)在弱酸性(pH
5.8)条件下能水解基质液中的α-醋酸萘酚，产生α-萘酚，α-萘酚再与六偶氮副品红偶联形成不溶性暗红色偶氮副品红萘酚沉淀，定位于胞质内酶活性处。
滴管、载玻片、37℃水浴箱、显微镜等。
（1）固定液：40%甲醛溶液。
（2）0.07mol/L
PBS(pH7.6)：取磷酸氢二钾溶液(磷酸二氢钾0.93g溶于蒸馏水100ml中)13ml，加磷酸氢二钠溶液(磷酸氢二钠0.95g溶于蒸馏水100ml中)87ml，充分混合而成。
（3）六偶氮副品红溶液：将2mol/L
HCl配制的4%副品红溶液3ml与4%亚硝酸钠溶液3ml(新鲜配置)混合。
（4）α-醋酸萘酚溶液：0.05gα-醋酸萘酚溶于50%丙酮2.5ml，4℃避光保存。
（5）温育液：将六偶氮副品红溶液3ml加入0.07mol/L磷酸缓冲液(pH7.6)44.5ml中，再慢慢滴加α-醋酸萘酚溶液1.25～2.5ml，充分混匀，溶液呈淡黄色，并用1mol/L
NaOH调节pH至6.0，过滤后4℃保存备用。
（6）复染液：2%甲基绿溶液。
【方法步骤】
1．新鲜涂片标本用甲醛蒸汽固定10min，流水冲洗5min，晾干。
2．将涂片置于温育液，37℃水浴箱中作用1h，水洗，晾干。
3．用2％甲基绿溶液复染5min，水洗，晾干。
4．镜检计数&
用油镜观察，胞质中有棕红色或暗红色颗粒，或弥散样红色小点为阳性反应细胞。观测200个被检细胞，并计算出ANAE阳性细胞数。
【注意事项】
1．温育液配制时，各溶液需边摇边加入，滴加过快易出现沉淀，影响染色效果。一般要求当时配制，且用过一次后即不能再用。
2．标本必须新鲜。制片后要尽快固定、干燥、冲洗，以免影响酶活力。
3．染色后冲洗要快，以防止酶反应的红色产物发生消褪。
4．应先通过预实验以选择适当的复染时间，因复染时间过长、染色过深、可掩盖部分细小ANAE颗粒，影响阳性检出率。
5．结果观察&
T细胞为ANAE阳性细胞，胞质内有大小不等、数量不一的紫红色颗粒或斑块；B细胞为ANAE阴性细胞，胞质呈黄绿色，胞质内无红色斑块；单核细胞为ANAE阳性，其胞质内有细小红褐色颗粒或斑块。
【参考范围】&
酸性α-醋酸萘酚酯酶(ANAE)主要分布在T淋巴细胞和单核细胞内；粒细胞、B淋巴细胞、红系细胞、巨核细胞和血小板中含量较少。
【临床意义】
1．有助于区分T淋巴细胞和B淋巴细胞&
ANAE染色在T淋巴细胞胞质中呈现点状颗粒或大块局限阳性反应；B淋巴细胞大多数为阴性反应，偶见稀疏弥散细小颗粒。
2．辅助鉴别急性白血病类型&
①T-ALL细胞：为点状或块状阳性，局限分布。②AML细胞：大部分呈阴性或弱阳性反应，M3细胞阳性反应较强，为弥散性分布。③AML-M5细胞：大多呈强阳性反应，胞质为均匀一致的弥散样淡红色或深红色，无点状颗粒。④AML-M4：原粒细胞呈阴性至弱阳性，原始及幼稚单核细胞呈阳性。
3．辅助诊断白血病和红白血病&
白血病和红白血病的异常幼红细胞可呈阳性。
白细胞动力学检验
一、肾上腺素激发试验
掌握肾上腺素激发试验的原理、方法、注意事项和临床意义。
肾上腺素激发试验（adrenalin
provocation test）是依据白细胞（主
要指中性粒细胞）由骨髓释放进入血流后，约半数进入循环池，半数粘附于血管壁构成边缘池，此边缘池的白细胞在外周血白细胞计数中不能得到反映。注射肾上腺素后血管收缩，粘附于血管壁上的白细胞脱落，从边缘池进入循环池，导致外周血白细胞数增高，其作用持续时间为20～30min。计数注射肾上腺素后外周血白细胞数，借此反映粒细胞的数量和分布情况。
1ml皮下注射用注射器、试管、移液管、载玻片、血液分析仪(血细胞计数板)、显微镜等。
（1）1%肾上腺素注射液。
（2）白细胞计数稀释液。
（3）瑞-吉染色液等。
【方法步骤】
1．受检者注射肾上腺素前作白细胞计数。
2．给受检者皮下注射0.1%肾上腺素注射液0.2ml。
3．注射前及注射后5、10、15、20、30min分别采血进行白细胞计数及中性
粒细胞分类计数(或注射前及后20min分别采血进行中性粒细胞计数)。
【注意事项】
1．受检者用药前白细胞计数，最好在清晨起床前采血，如条件不许可，应让受检者静息1h后采血检查。
2．应注意肾上腺素的副作用。肾上腺素有较强的收缩血管作用，注射后患者可有心悸、面色发白等反应。心、脑血管疾病及高血压病等患者不宜作本试验。
【参考范围】&
粒细胞上升值一般低于(1.5～2)×109/L。
【临床意义】&
本试验可用于鉴别粒细胞减少症是否为“假性”减少，是粒细胞减少症患者常用的实验室检查方法之一。白细胞减少者，注射肾上腺素后，如外周血白细胞能较注射前增加1倍以上或粒细胞上升值超过(1.5~2)×109/L，提示病人粒细胞分布异常，表示患者白细胞在血管壁粘附增多，即边缘池粒细胞增多，如无脾大，可考虑为“假性”粒细胞减少。如果增高低于上述值，则应进行其他检查，进一步确定白细胞减少的病因。
二、流式细胞术检测
掌握流式细胞术检测白细胞DNA的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】
流式细胞术(flow
cytometry，FCM)
分析白细胞DNA，是将待测细胞制成单个细胞悬液，先用胰蛋白酶除去细胞骨架和核蛋白，再用RNA酶消化掉细胞内的RNA，再经特异性DNA荧光染料碘化丙啶（PI）与细胞中双链DNA分子特异结合染色，经PI染色的DNA分子在激发光的激发下产生红色荧光，而DNA含量与荧光染料的结合量即荧光强度成正比。通过FCM检测每个细胞荧光信号的强弱来反映每个细胞的DNA含量，检测数据经计算机相应软件处理后可获得DNA含量的直方图，各细胞周期时相细胞的百分比、有无异倍体和异倍体的类型等参数，借此了解细胞的增殖状态。
吸管、移液管、试管、水浴箱、流式细胞仪等。
（1）PBS缓冲液(pH
7.4，无钙、镁离子)
8.0g、KH2PO4
0.2g、Na2HPO4
1.15g，加蒸馏水至1000ml。
（2）碘化丙啶(Propidium
iodide，PI)染液（50μg/m1）：取5mg
PI溶于100ml
PBS中，装在棕色瓶中，4℃贮存备用。
（3）0.25%胰蛋白酶：以0.01%Hanks液配成0.25%浓度，临用前用5.6%NaHCO3，调整pH为7.4。
（4）0.0l%RNA酶A：用1%枸橼酸钠溶液稀释成5000U/ml，并在75℃下热处理30min，使其中的DNA酶失活，然后分装冷冻贮存。
【方法步骤】
1．将骨髓单层培养细胞(对数生长期)中的旧培养液倒掉。
2．加入少量0.25%胰蛋白酶，过一遍瓶后倒掉。加入1～2ml
0.25%胰蛋白酶，在倒置显微镜下观察，见细胞稍变圆时，静消化2～3min，待细胞逐渐变白，有脱落趋势时，立即竖立培养瓶，停止胰蛋白酶作用，弃去胰蛋白酶。
3．加入3~4ml
PBS，用吸管反复吹打，使成为单个细胞悬液，移入离心管中。离心去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散。
4．固定悬液细胞&
用细滴管或注射器将细胞迅速注入70%的4℃冷乙醇中，然后置4℃冰箱保存。
5．调整上述细胞悬液浓度至1×106/ml，取1ml细胞悬液，用PBS洗涤离心，重复2次，弃上清液，留下0.5ml。
6．加入RNA酶A(100μg~200μg)，37℃水浴中温育30min后，立即放入冰浴中，以停止RNA酶A的作用。
7．加入PI染液1.5ml(50μg/ml)进行DNA染色，样品置冰浴中避光染色至少30min。
8．用300目的尼龙膜或35μm的细胞过滤器过滤细胞。
9．上机检测&
测定前应检查仪器状况，DNA直方图的道数值应至少为512，G1峰道数值不低于最大道数的1/5；阈值应设在DNA的荧光参数上。
【注意事项】
1．碘化丙啶染液（PI）须在配置后两周之内使用。
2．样品应在开始染色后48h内测定，最好在24h之内进行。
3．PI是嵌入到双链DNA和RNA的碱基对中与之结合，无碱基特异性。为了获得DNA分布参数，染色前必须用RNA酶处理细胞，排除双链RNA的干扰。
4．DNA定量荧光染色分析技术，要求细胞的DNA染色均匀，以保证染色技术达到染料分子数与被染的DNA含量成比例关系，故采用本法应掌握好染料浓度。
5．上机前应轻轻混匀细胞悬液。
6．流式细胞术中所测得的量都是相对值，因此每次测量、每批样品都要有对照组。
7．为获得较低的CV值，建议使用低速进样，获取速率最好少于60个细胞/s。
【判断结果】
（1）DNA直方图分析：计算机以横坐标表示荧光强度即DNA含量，以纵坐标表示相对细胞数，绘制出DNA直方图。DNA含量高的细胞发射的荧光强，在DNA直方图的右侧，含量低的细胞发射的荧光弱，在直方图的左侧。DNA含量随细胞增殖周期的不同而有差异，如果将Go/G1期的DNA含量看成2C、则G2/M期应为4C，S期在2C～4C之间。DNA直方图上第一个峰表示Go/G1期，第二个峰表示G2/M期，两峰之间为S期。
（2）DNA倍体分析：DNA指数（DI）=样品细胞Go/G1期DNA峰荧光平均值/正常同源组织二倍体细胞DNA峰荧光平均值。
不同倍体细胞DI值：二倍体为0.9～1.1、近二倍体为0.85～1.15、四倍体为1.9～2.1、多倍体为＞2.1
（3）细胞周期各时相细胞的百分比分析：细胞周期各时相包括Go/G1期、S期和G2/M期，计算细胞周期各时相细胞的百分比。其中S期细胞百分比也叫SPF(S-phase
fraction，SPF)。
SPF(%)＝[S÷(Go/G1+S+G2/M)]×100%
细胞增殖指数(proliferous
index，PI)(%)＝[(S+G2M)÷(G0/1+S+G2M)]×100%
【临床意义】
本试验可反映肿瘤的生物学特性，可用于白血病的诊断和鉴别诊断、预测患者预后和评价药物治疗疗效等。
1．有助于急性白血病的诊断&
根据DNA直方图，白血病患者在未经治疗时其白血病细胞G1―S有阻滞，SPF明显低于正常骨髓细胞，但治疗后有好转。
1．有助于白血病疗效和预后判断&
S+G2/M期低的患者提示有较长的生存期；S+G2/M期高者常早期死亡。此外，急性白血病患者，DNA非整倍体在完全缓解后消失，在临床复发前可重现。在CML慢性期时，若非整倍体持续存在则病情多不稳定，易急变。
3．指导白血病化疗&
SPF高的白血病患者，常对周期特异性药物较为敏感，完全缓解率高，可定期了解细胞增殖状况并指导临床用药诱导静止期白血病细胞进入S期，以提高化疗效果。但SPF高者容易复发。
4．辅助白血病的鉴别诊断&
RIG0/G1 (RI：RNA指数)在AML组明显高于ALL组，借此可鉴别AML与ALL。
三、粒细胞抗体检测
掌握间接荧光法检测粒细胞抗体的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】
粒细胞抗体检测（assay
for antibody of granulocyte），可利用间接荧光法，即在正常人粒细胞悬液中加入受检者血清，如血清中有粒细胞抗体，抗体便与正常人粒细胞结合，再加入荧光素标记的兔(或羊)抗人免疫球蛋白与其结合，可使粒细胞显示荧光反应，借以反映血清中有无粒细胞抗体。
吸管、移液管、试管、离心机、37℃水浴箱、显微镜等。
（1）2.5%EDTA
Na2-Tris缓冲液：EDTA
0.9g，Tris
6.06g，NaCl
16.13g，加蒸馏水至1000ml。
（3）1%EDTA
Na2磷酸盐缓冲液：EDTA
Na2 l0.0g，NaCl
8.0g，Na2HPO4?12H2O
2.9g，KH2PO4
0.2g，加蒸馏水至1000ml。
（4）粒细胞分离液：①密度1.097聚蔗糖-泛影葡胺混合液：14.6%聚蔗糖24ml，34%泛影葡胺l0ml，如密度小于1.097时，用34%泛影葡胺调节。如密度大于1.097时，用14.6%聚蔗糖调节。②淋巴细胞分离液(相对密度1.007±0.001)。
（5）1%甲醛磷酸盐缓冲液。
（6）磷酸盐缓冲液(PBS)：NaCl
8.0g，KH2PO4
0.2g，Na2HPO4
1.44g，KCl
0.28g，加蒸馏水至1000ml。
（7）0.2%牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液。
（8）荧光素标记的兔(或羊)抗人免疫球蛋白血清。
（9）O型健康人粒细胞悬液：①取数支圆底试管，每管加入密度1.097聚蔗糖-泛影葡胺混合液2ml左右。再沿每管管壁缓缓加入密度1.077聚蔗糖-泛影葡胺混合液2ml左右，使此混合液重叠在1.097混合液的液面上；②另取一支试管，加入2.5%EDTA
Na2溶液lml和O型正常人血液9ml，混合。用EDTANa2-Tris缓冲液将此血液作4倍稀释(抗凝血液l份+缓冲液3份)，混合。将稀释的正常人血液用吸管沿管壁缓缓加于上述含粒细胞分离液的试管内，每管约加6～7ml，使稀释血液重叠在比重为1.077的分离液的上面；③
800×g离心3min后可分成三层细胞，底层是红细胞层，上层是淋巴细胞和血小板层，中间层为粒细胞层；④
用吸管将上层清液、淋巴细胞层和血小板层吸去。将中层的粒细胞全部吸于另2支试管中，加入0.1%EDTA磷酸盐缓冲液至近管口，颠倒混合，400×g离心5min，弃去上层液体，将分离所得的粒细胞用1%甲醛磷酸盐缓冲液固定5min；⑤用PBS洗3次，最后用PBS配成粒细胞数为10×109/L的粒细胞悬液。
（10）被检血清。
【方法步骤】
1．取2支试管，按表4-2进行。
粒细胞抗体测定
加入物(m1)&&&&&&&&&&&&&&
测定管&&&&&&&&&
被检血清&&&&&&&&&&&&&&&&&&
0.1&&&&&&&&&&&& 一
健康人AB型血清
&&&&&&&&&&一&&&&&&&&&&&&&
O型正常人粒细胞悬液&&&&&&
0.1&&&&&&&&&&&& 0.1
2．混合后，放置37℃温箱温育30min。
3．用0.2%牛血清白蛋白缓冲液将粒细胞洗3次。
4．加入荧光素(异硫氰酸)标记兔(或羊)抗人免疫球蛋白血清0.1ml，混合，37℃中放置30min。
5．分别用0.2%牛血清白蛋白缓冲液洗3次。
6．镜检计数&
各取一滴粒细胞悬液置于载玻片上，用荧光显微镜观察粒细胞是否呈荧光反应，且记录具有荧光反应粒细胞的百分比。
7．判断结果&
如测定管显荧光反应粒细胞的百分率高于对照管为阳性反应(如用荧光标记抗IgG血清抗体检查，若显荧光反应，说明粒细胞抗体是IgG型）。
【注意事项】
1．所用载玻片、吸管、试管等均应清洁、消毒，以免影响结果。
2．取新鲜全血，尽快收集血清，若未能及时检测，应冰冻保存。
3．本试验应特别注意排除非特异性荧光的干扰。非特异性荧光的来源很多，包括：来自微生物或组织的自发性荧光、荧光抗体试剂本身的荧光、正常血清及免疫血清的荧光、荧光抗体技术本身造成的荧光。这些非特异性荧光严重干扰了结果判断，应通过对照进行鉴别和排除．或通过对抗原、抗体、荧光素提纯、调整荧光素抗体结合物二者比例等方面加以排除。
4．每次洗涤要充分。
5．荧光染色后的标本最好在当天观察，否则随时间延长荧光强度会逐渐下降。故标本不宜长时间保存。
【参考范围】&
健康人血清阴性。
【临床意义】&
粒细胞抗体的靶抗原是中性粒细胞表面的Fc受体Ⅲ
(FcR3)、补体受体Ⅲ(CR3)等，阳性反应表示病人血清中有粒细胞抗体，见于多次输血后并由此引起急性输血性肺损害(TRALl)、新生儿免疫性中性粒细胞减少症、系统性红斑狼疮(SLE)、Felty综合征及其他自身免疫性疾病。
白细胞免疫标记检测
一、荧光显微镜计数检测
掌握荧光显微镜计数检测白细胞免疫标记的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】
荧光显微镜（fluorescence&
microscope
）计数检测白细胞免疫标记，是将抗体标记上荧光素制成的荧光抗体，在一定条件下与细胞表面的分化抗原相结合，洗去游离的荧光抗体后，结合于细胞表面的荧光素在荧光显微镜特定波长激发光的照射下，发出一定波长的荧光，有明显荧光现象就证明有与荧光抗体特异结合的抗原存在，借此可对标本中的表面标志作出鉴定和定位。可根据标记物和反应程序的不同进行分类：直接荧光法，即将荧光素直接标记在特异性抗体上，直接与相应抗原起反应，根据荧光有无来检测抗原；间接荧光法：将荧光素标记抗抗体，待基质标本中的抗原与相应抗体(一抗)反应后，再用荧光标记抗抗体(二抗)结合第一抗体，呈现荧光现象。另外还有双标记法，即用两种荧光素分别标记不同抗体，对同一基质标本进行染色，可使两种抗原分别显示不同颜色的荧光，主要用于同时观察细胞表面两种抗原的分布与消长关系。常用异硫氰酸荧光素(F1TC)和藻红蛋白(PE)作双重标记染色，前者发黄绿色荧光。后者发红色荧光。本法特异性强且与形态学相结合，可用于检测新鲜或陈旧标本，或污染杂菌的标本，并可对组织中抗原或抗体进行定位检查，以及追踪抗原的分布等。
离心管、滴管、载玻片、盖玻片、37℃水浴箱、振荡器、冷冻离心机、荧光显微镜等。
（1）HanKs液。
（2）淋巴细胞分离液(相对密度1.007±0.001)。
（3）白细胞洗涤液(0.11mol/L
PBS，pH7.2)：磷酸氢二钠(Na2HPO
4?12H2O)28.37g、磷酸二氢钠(NaH2PO4?2H2O)4.82g，以蒸馏水溶解并稀释至1000ml(含0.5%小牛血清清蛋白和0.1%NaN3)。
（4）第一抗体：均为异硫氰酸荧光素(FITC)标记或未标记的鼠抗人白细胞分化抗原单克隆抗体。可根据实验需要选用相应单抗。如：
抗T细胞系单抗：CD1~8等。
抗B细胞系单抗：CD9、CD10、CD19~22、CD72、CD77、CD79a、Igκ、Igλ等。
抗粒、单核细胞系单抗：CD11b、CD13~16、CD33~36CD66b、MPO、等。
抗巨核细胞系单抗：CD41a、CD41b、CD42b、CD36、CD61。
抗血小板单抗：CD9、CDw17、CD31、CD36、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、
抗红细胞系单抗：血型糖蛋白A/H。
前体细胞及非特异性的单抗：CD34、CD38、HLA-DR等。
（5）第二抗体：FITC荧光素标记的兔(或羊)抗鼠免疫球蛋白。
（6）甘油、NaN3等。
【方法步骤】(间接免疫荧光法)
1．标本采集&
取肝素抗凝的骨髓2ml或外周血20ml(肝素10U/m1)。
2．制备白细胞（单个核细胞）悬液&
待测标本用HanKs液稀释5倍，取另一支试管加入淋巴细胞分离液3ml，用滴管将稀释的标本5ml缓缓叠加于分离液上，形成清晰的界面，于4℃
2500r/min离心15min，小心取出白细胞层于另一试管中，2500r/min离心10min，吸掉上清液，下层白细胞用HanKs液洗涤，以800r/min离心20min，吸掉上清液(含血小板)，重复洗涤2次，管底血细胞用PBS
200μl配制成细胞悬液，使单个核细胞浓度为（4～10）×109/L。
3．加一抗&
加入适当稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白（PE）标记或未标记的鼠抗人白细胞分化抗原单克隆抗体，置37℃水浴温育1h，用PBS(不含BAS)洗涤3次，沉淀细胞用PBS
200μ1悬浮。同时以鼠抗羊IgG作为阴性对照。
4．加荧光标记二抗&
加入不同比例稀释的荧光标记的二抗，37℃水浴温育lh。
5．制备荧光标记的细胞悬液涂片&
反应完成后，管底加含60%甘油的PBS
5～10μl，取细胞悬液10μl于清洁载玻片上，然后盖上盖玻片，让细胞悬液均匀弥散。静置1h。
6．计算结果
【注意事项】
1．白血病细胞极易破碎，洗涤过程中应特别小心。
2．许多因素可以影响荧光的强度：①pH的改变可引起荧光色素光谱的改变，影响荧光色素吸收和发射的光量子数。②环境温度高易引起荧光淬灭。在20℃以下的环境检测，其发光效率基本保持恒定。③在一定浓度范围内，荧光强度随荧光色素浓度增加而增加。
3．每次试验必须做阴性对照，以鉴别特异性和非特异性荧光物质，以免非特异性荧光的干扰影响结果的判断。阴性对照应包括：①用与特异性抗体种属相同的动物血清（如鼠抗羊IgG）代替特异性抗体。②染色抑制试验：将未标记荧光素的抗体先与基质标本中的抗原反应，然后再加荧光素标记的相同抗体。③用PBS代替荧光抗体。④标本自发荧光对照，即基质标本经PBS洗后不加荧光抗体。
4．计数前应先将细胞悬液进行离心沉淀、涂片、瑞-吉染色，用光学显微镜观察，以便了解悬液中含有哪些细胞成分。
5．因荧光容易消褪，不宜保存及制备永久性标本。故荧光抗体染色后的标本，应低温避光放置，尽量及时镜检，最好在染色当天即作好镜检，以防荧光消褪，影响结果。
6．荧光显微镜检查应在通风良好的暗室内进行。同时，由于荧光阳性细胞在强光源的照射下荧光强度可迅速减弱、计数时应先于荧光光源下快速观察和确定带荧光的细胞，然后在普通光源下计数同一视野的白细胞数并进行形态鉴别。
7．直接免疫荧光法的优点是特异性强，缺点是检查不同的抗原就必须制备相应的荧光抗体，即每检查一种抗原就要制备一种相应的特异抗体，成本较高。间接法比直接法敏感性高，制备一种荧光抗体（二抗）可用于检查多种抗原，但易出现非特异性荧光，且试验需要多种对照，操作较麻烦、费时。
【结果判断】
在荧光显微镜下，选择细胞分散较好的视野，自下向上、从左向右，先计数荧光反应细胞，然后在普通显微镜下计数同一视野的白细胞数。膜荧光阳性细胞有三种类型：①完整的膜荧光为一与细胞吻合的翠绿圆圈；②帽状荧光。
= 3 \* GB3 ③点状荧光。荧光强度根据以下标准判定：
阴性：无荧光。
弱阳性(±)：极弱的可疑荧光。
阳性(+)：荧光较弱但清楚可见。
(++)：荧光明亮。
(+++～++++)：荧光闪亮或耀眼的强荧光。
二、流式细胞仪计数检测
掌握流式细胞术检测白细胞免疫标记的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】&
将分离的白细胞标本用荧光标记单克隆抗体染色制备成悬液，使快速流动液体中荧光标记的细胞逐个地通过仪器的检测区，仪器通过分别辨认细胞形态大小和荧光特征，将细胞分别计数，并计算标上荧光的各组细胞的百分比，由此可测得白细胞表面抗原，此法称为荧光活化细胞分选法(flow
cytomatric cell sorting，FACS)。用多种不同特异性的荧光标记单抗染色，进行多色荧光分析，可同时检测单个细胞上表达的多种细胞表面分子。此外，用流式细胞仪检测，可分析一群较纯细胞的表面标志，也可用门技术(gating)把其他细胞排除于被分析的细胞外。
试管、移液管、滴管、37℃水浴箱、振荡器、冷冻离心机、流式细胞仪。
（1）Hanks液
（2）淋巴细胞分离液(相对密度1.007±0.001)。
（3）白细胞洗涤液(0.1mol/L
PBS，pH7.2)：磷酸氢二钠(Na2HPO4?12
H2O)28.37g，磷酸二氢钠(NaH2PO4?2
H2O)4.82g，以蒸馏水溶解并稀释至1000ml(含0.5%小牛血清白蛋白和0.1%NaN3)。
（4）第一抗体：异硫氰酸荧光素(FITC)标记或未标记的鼠抗人白细胞分化抗原单克隆抗体(McAb，单抗)。
（5）第二抗体：
FITC标记的兔(或羊)抗鼠免疫球蛋白。
【方法步骤】
1．取血样&
取肝素抗凝的骨髓2ml或外周静脉血20ml(肝素10U/ml)。
2．制备白细胞（单个核细胞）悬液&
将待测标本用HanKs液稀释5倍，取另一支试管加入淋巴细胞分离液3ml，用滴管将稀释的标本5ml缓缓叠加于分离液上，形成清晰的界面，于4℃
2500r/min离心15min，小心取出白细胞层于另一试管中，2500r/min离心10min，吸掉上清液，下层白细胞用HanKs液洗涤，以800r/min离心20min，吸掉上清液(含血小板)，重复洗涤2次，管底血细胞用PBS
200μl配制成细胞悬液，使单个核细胞浓度为（4～10）×109/L。
3．加一抗&
加入适当稀释的FITC或藻红蛋白（PE）标记或未标记的鼠抗人白细胞分化抗原单克隆抗体，置37℃水浴温育1h，用PBS(不含BAS)洗涤3次，沉淀细胞用PBS
200μ1悬浮。
4．加荧光标记二抗&
加入不同比例稀释的荧光标记的二抗，37℃水浴温育lh(直接法不做此步)。
5．制备荧光标记的白细胞悬液&
用含0.1%NaN3的PBS洗2次，弃去上清，沉淀悬浮于PBS中。
6．检测计数&
利用流式细胞仪，以激光功率260Mw，激光波长448nm，经550nm短通道滤光片检测绿色荧光。通常计数分析5000个细胞。
【结果判断】
用流式细胞术获取的检测数据以直方图形式表示。
1．一维单参数直方图&
是一维数据应用最多的图形，可用来定性和定量分析。图中的横坐标表示荧光信号或散射光强度的相对值，其单位用“道数”(channel)表示。“道”即多道脉冲分析器中的道，也可看成相对荧光(或散射光)的单位。横坐标可以线性，或对数表示。直方图的纵坐标通常代表细胞出现的频率或相对细胞数。
2．二维点阵图&
要显示两个独立数与细胞定量的关系时，通常以二维的点阵图表示。横坐标和纵坐标可分别以不同的散射光和荧光信号表示，可同时观察到双参数。例如点阵图的横坐标是CD8淋巴细胞的相对含量，纵坐标是CD4细胞的相对含量。图上每一点代表1个细胞，每个点与纵轴的距离即表示该点的相对值CD4值。可以由二维点阵图得到两个直方图，但两个直方图无法反演成一个二维点阵图，这说明一个点阵图所携带的信息量大于两个直方图所携带的信息量。
【数据分析】
流式细胞术分析免疫荧光样品主要获取二项参数：免疫荧光阳性细胞百分比和荧光强度。免疫荧光多采用非参数方法，计算各部分细胞百分比，只要计算3个峰下面的面积即可。在峰间“谷”的最低处划一条垂直于横坐标的直线，3个峰以直线为界，逐个计算峰下的细胞数并与总细胞数相比，求出3种细胞在整个细胞群体中所占的百分比，并计算免疫荧光阳性细胞百分比和荧光强度。免疫荧光阳性细胞群体及荧光强度的判定对不同细胞亚群的免疫荧光测定时，应有一个阈值标准作为确定为阳性群体的界限。单道荧光直接染色法因在直方图标上形成两个明显独立的群体峰，标准容易确定。但用间接荧光法时，为了排除红细胞干扰,目前推荐用对照组曲线同实验组曲线交叉法，即以交叉点为界，分别计算出阳性组曲线覆盖面积及对照组延伸到阳性组下的面积，以前者减去后者获得的数据，即为阳性组细胞群体所占比例。为了使免疫荧光的定量概念更加完整，在阳性细胞群体百分比基础上加入荧光强度指标。此值除了按对照组及实验组的曲线峰值常规确定外，更准确的是以拟合曲线法估计荧光强度的平均值和标准差。
【注意事项】
1．骨髓和血液标本以肝素抗凝较好。最好在化疗之前采集标本，因化疗常导致细胞抗原表达不规则，使结果难以分析。一般认为初治病例免疫分型结果客观、可靠。
2．白血病细胞极易破碎，洗涤过程中应特别小心。
3．计数前应先将细胞悬液进行离心沉淀，并染色观察悬液中的细胞成分，以利于上机后各种参数的设定。
4．必须同时作鼠抗羊IgG（亚类应与McAb相同，标记相同荧光素）阴性对照，以便消除非特异荧光的干扰。
5．当骨髓或血液原始加幼稚白血病细胞＞30%时，分型结果较为可靠。分型结果与形态学不同时，应进行综合分析。
6．当原始加幼稚白血病细胞＞50%时，可直接用骨髓或血液检查，但应先加溶血剂使红细胞破坏，再用磷酸盐缓冲液洗涤并定容（约0.5ml）后再测。
7．计数应在4h内完成。
三、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标记法检测
【目的】掌握碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标记法检测白细胞免疫标记的原理、方法、注意事项和临床意义。
【原理】碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(alkaline
phosphatase antialkaline phosphalase，APAAP
)桥联酶标记法，是用牛肠碱性磷酸酶(ALP)和鼠抗碱性磷酸酶单克隆抗体结合制备成一种可溶性碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APAAP)复合物。以鼠抗人单克隆抗体为第一抗体，与待测细胞表面抗原结合；兔（羊）抗鼠抗体为第二抗体，其Fab段可分别连接第一抗体和APAAP复合物，起桥联作用。加入APAAP复合物，通过APAAP中的碱性磷酸酶催化底物显色，以显示抗原定位及鉴定细胞抗原的种类。
&刻度离心管、移液管、37℃水浴箱、水平式离心机、离心涂片机、显微镜等。
（1）Hanks液。
（2）淋巴细胞分离液(相对密度1.007±0.001)。
（3）第一抗体：均为鼠抗人单克隆抗体(McAb，单抗)。
（4）第二抗体：兔抗鼠IgG，为桥联抗体。
（5）APAAP复合物：用ALP和鼠抗ALP单抗按适当比例混合制成。
（6）碱性磷酸酶底物液：α萘酚AS-BI磷酸盐-坚固红TR盐底物显色系统：haphtholAS-MX
phophate 2mg；dimethyformamide
0.2ml；0.1mlTris缓冲液(pH8.2)9.8ml；lmol／L
Levamisole 10μl。待完全溶解后置C20℃，可保存数月。用前加入坚固红TR盐10mg；溶解后将液体直接滴到标本上。
（7）FAB固定液(pH6.6)：取Na2HPO4
20mg、KH2PO4
100mg、丙酮45ml、加蒸馏水30ml，充分搅拌均匀、过滤，调pH至6.6，置4℃备用。
（8）PBS缓冲液(pH7.4)：取KH2PO4
0.2g、Na2HPO4
2.9g、NaCl
18g，以蒸馏水溶解并稀释至1000ml，充分搅拌均匀，调pH至7.4备用。
（9）甘油明胶：取明胶10g，加蒸馏水60ml，加热溶解(不用搅拌)，加甘油70ml，再加苯酚0.25g。每次使用前水浴加热溶化。
（10）Mayer苏木素染液：取苏木素0.1g、钾明矾5g、碘酸钠0.02g，加至100ml蒸馏水中，加热搅拌使溶解，再加枸橼酸钠0.1g，水合氯醛5g，混合后煮沸5min，冷却、过滤后备用。
【方法步骤】
1．标本采集&
取肝素抗凝的骨髓2ml或外周静脉血6～10ml(肝素10U／ml)。
2．分离单个核细胞&
（1）将侍测标本用Hanks液(或无菌生理盐水)稀释2～3倍。
（2）取一离心管加入淋巴细胞分离液3ml，用滴管将稀释的标本沿试管壁缓缓叠加于淋巴细胞分离液上，形成清晰的界面。稀释标本与分离液的比容为3∶1。
（3）以400g离心20min，离心后可见试管内液体分层，从底部到液面依次为红细胞和粒细胞层、分离液层、单个核细胞层、稀释液与血浆层。
（4）用滴管直接吸出单个核细胞层，置于另一离心管中，用PBS洗2次，每次1100g离心10min，弃去上清液，最后根据实验需要调整细胞浓度为1×108/ml。
3．制备待检细胞涂片
（1）离心涂片机法：①取特制离心杯，将有圆孔滤纸对准且紧贴于离心杯下侧的圆孔周围，滤纸上压一张洁净的画有一圆圈的载玻片；②
压离心圆槽中的钢片夹，将离心杯孔连同画有圆圈的载玻片对准，一起插入槽内；③ 取调整后1×108/L细胞50μl加于杯底；④
盖上保护盖，以500r/min离心2min；⑤取出的载玻片可见圆形印迹，置室温中自然干操，一般常用纯丙酮在室温中固定5min，固定后可立即进行免疫组化标记，亦可用塑料薄膜包好后置-20℃以下保存。
（2）干抗原载玻片法：将细胞悬液滴加在干抗原载玻片的圆圈内，每个圆圈内加20μ1(根据试验需要可在多个圆圈内加20μl)，置室温中自然干燥，待用。
（3）手工法：将细胞悬液滴于涂有一层粘片剂的载玻片上，然后再回吸液滴，剩下一薄层细胞，快速吹干。也可用悬液推制成片，自然干燥，待用。
4．APAAP免疫酶染色
（1）固定涂片：将涂片放入装有4℃
FAB固定液的染色缸内，固定30s，用PBS洗2次，每次5min，吹干。
（2）封闭：每个圆圈内各加灭活的10%羊血清20μl，置37℃湿盒内作用30min。
（3）加一抗：吸干标本周围多余的液体，滴加工作浓度(按效价稀释)的第一抗体20μl，将载玻片置湿盒内室温孵育30~60
min或4℃过夜。PBS洗3次，每次3min。
（4）加二抗：吸干标本周围多余的液体，滴加第二抗体20μl，置湿盒内室温孵育30min。PBS洗3次，每次3min。
（5）加APAAP复合物：吸干标本周围多余的液体，滴加APAAP复合物20μ1，湿盒内室温孵育30min，PBS洗3次，每次3min。如需增强染色强度可再次滴加第二抗体，APAAP复合物各一次，每次室温孵育15min。
（6）加底物显色：临用前取底物液，按每ml底物液加1mg坚固红的比例加入坚固红，充分混匀。于每张涂片滴加碱性磷酸酶底物50μ1。37℃水浴箱内显色l0～30min。可在低倍镜下观察，待显色明显时，用蒸馏水轻轻冲洗30s，以中止显色。
（7）复染、封片：加苏木素复染l～3min，自来水冲洗。如核着色太深影响观察时，可用1%HCl分色5～10s。加甘油明胶封片。
【注意事项】
1．用于白血病分型时，标本以骨髓液为好，若用外周血，白血病细胞数应占单个核细胞30%以上，结果才有参考价值。
2．尽量在化疗之前或停止化疗至少3～4周以上采集标本，以免因化疗导致细胞抗原性改变而影响结果。
3．固定时间要准确，时间过长可影响细胞表面的抗原活性。
4．白血病细胞容易破碎，洗涤过程中应特别小心。
5．抗体效价要适当；需同时作阴性对照。
6．温度控制在37℃，反应活性最佳。抗体反应必须在湿盒内孵育，不能干片。每次洗涤后应及时吸干多余洗液，以免稀释抗体。
7．APAAP试剂盒必须低温保存，分装后的试剂反复冻融效果会明显降低。
8．本法以左旋咪唑抑制中性粒细胞的内源性碱性磷酸酶，对外源性牛肠碱性磷酸酶的活性没有影响。其用量可根据标本中成熟中性粒细胞的数量和内源性ALP活性而定。
9．可进行多重细胞免疫标记检测，常可用ABC-APAAP双标记法。
【判断结果】&
于高倍镜下观察，根据细胞膜或细胞质有无玫瑰红色颗粒(或)弥散状阳性沉淀物判断如下：
阴性细胞：细胞膜和细胞质无红色沉淀物，胞核复染后呈蓝色。
阳性细胞：细胞膜或细胞质有玫瑰红色颗粒和(或)沉淀物。
（+）：细胞上有浅红色沉淀物。
（++）：细胞上有深红色沉淀物。
镜检计数：高倍镜下计数100~200个待测细胞/每孔，算出每孔标记阳性细胞的百分率，该百分率分别代表各单抗所针对抗原的阳性百分率。
四、生物素-亲合素酶标法检测
【目的】掌握生物素-亲合素酶标法检测白细胞免疫标记的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】生物素-亲合素酶(avitin-biotin-peroxidasecomplex，ABC)标记法，是依据亲合素(avitin)和生物素(biotin)二者间有很强亲和力，生物素可以和抗体相结合，且结合后仍保持与亲合素强大的亲和力。将辣根过氧化物酶标记在亲合素-生物素复合物上，形成亲合素-生物素-过氧化物酶复合物，即ABC。细胞抗原成分与特异性抗体（第一抗体）结合后，与已标记上生物素的第二抗体起反应，二抗中的生物素再与ABC结合。通过ABC上辣根过氧化物酶作用于显色剂，使其产生有色沉淀，指示抗原存在部位。
刻度离心管、移液管、微量移液器、振荡器、水平式离心机、离心涂片机、显微镜等。
（1）Hanks液
（2）淋巴细胞分离液(相对密度1.007±0.001)。
（3）第一抗体：均为鼠抗人单克隆抗体，同APAAP法。
（4）第二抗体：标记有生物素的兔抗鼠IgG，为桥联抗体。
（5）PBS缓冲液(pH7.4)：A液：Na2HPO4?12H2O
23.88g，蒸馏水1000ml。B液：KH2PO4
9.08g，蒸馏水1000m1。取A液86ml+B液14ml，加入NaCl
0.87g充分搅拌均匀，调pH至7.4备用。
（6）0.1%戊二醛PBS液。
（7）标有辣根过氧化酶的亲合素。
（8）底物液的配制：①底物缓冲液的配制：A液：溶2mg
naphthol ASMX phosphate free acid于0.2ml
N，N-dimethylformaide中；
B液：溶2.4mg
levamisole于9.8ml
pH 8.2的TBS中(TBS配制：A’液0.5
mol/L pH 8.2的Tris-HCI缓冲液，溶3gTris于50ml无离子水中，用HCl调pH至8.2。B’液溶4.388g
NaCl于500ml无离子水中。取1份A’液与9份B’液，混匀)。
②底物液配制：临用时取A液49份加B液1份混匀，按1g/L浓度加入固红，震荡使溶解。
（9）封片剂。
（10）苏木素染液等。
【方法步骤】
&& 1．制备单个核细胞涂片&
分离骨髓或外周静脉血单个核细胞，制备细胞涂片，具体同APAAP法。于干燥的细胞涂片上加0.1％戊二醛PBS液50μ1。2min后，用PBS洗涤。
2．标记细胞&
用玻璃铅笔在涂有细胞的载玻片背侧沿细胞外沿画一圈，以标记细胞。
3．加一抗&
滴加50μ1适当稀释的一抗于细胞上。平置载玻片于湿盒内，置室温30min或4℃过夜。用PBS洗涤(注意：每次淋洗后圈外及载玻片背面的PBS液均需擦干)。
4．加二抗&
滴加50μ1适当稀释标记生物素的二抗于细胞上。置湿盒内室温30min。用PBS洗涤。
5．加亲合素化酶
&滴加50μ1适当稀释的标有辣根过氧化酶的亲合素于细胞上。置湿盒室温30min。用PBS洗涤。
6．浸泡过氧化氢&
将涂片浸人装有2％过氧化氢的染缸浸泡30min，以消除内源性过氧化氢，水洗后速入PBS液洗涤。
7．加入ABC复合物30min，用PBS洗涤。
8．滴加底物液50μ1于细胞上。室温显色15min左右，待显淡红色，用PBS洗涤。
滴加50μ1苏木素液于细胞上，立即用PBS洗涤。
10．滴加封片剂于细胞上，加盖片封片。
11．镜检计数及判断结果&
细胞表面染有红色者为阳性细胞。高倍镜下计数200个细胞。计算阳性细胞百分率，同APAAP法。
【注意事项】
基本同APAAP法1～6项。嗜酸性粒细胞的内源性过氧化酶不能完全清除，胞质嗜酸性颗粒出现假阳性。&&&&&&
【临床意义】
1．采用抗人白细胞分化抗原CD系列单克隆抗体，应用流式细胞术、荧光标记及APAAP酶标等技术分析T细胞亚群(T3、T4、T8)，是评价细胞免疫调节功能的重要指标，也是临床医学研究的重要方法。
2．有助于急性白血病的免疫分型&
由于分化停滞于某一阶段及克隆异常增殖的白血病细胞可出现不同的细胞表面标记，形成白血病的不同亚型、应用上述技术联合检测，并进行综合分析判断，可对白血病进行免疫分型，对白血病的诊断，指导白血病治疗以及判断预后也有重要意义。
3．有助于慢性白血病的诊断及鉴别诊断。
&&& 4．有助于淋巴瘤免疫分型诊断。
&&& 5．监测白血病疗效&
在监测白血病免疫疗效
(自体骨髓移植及异体骨髓移植)和微量残留白血病细胞免疫检测应用中更具灵敏性和直观性。目前主要用于急性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤的检测。
&&& 6．有助于病态巨核细胞研究，对巨核细胞白血病及骨髓增生异常综合征的诊断有重要参考价值。
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（林东红）}