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流式细胞术检测HLA-B27抗原的表达及意义
目的 通过流式细胞术对外周血白细胞HLA-B27抗原的检测,了解腰背疼痛和/或关节疼痛患者HLA-B27抗原的分布情况,探讨其在风湿性疾病中的临床应用价值.方法 采用流式细胞仪检测腰背疼痛和/或关节疼痛患者372例HLA-B27抗原的表达.结果 327例患者中HLA-B27阳性163例,总阳性率为43.82%,其中男性259例,HLA-B27阳性137例,阳性率为52.90%.女性113例,HLA-B27阳性26例,阳性率为23.00%.HLA-B27阳性患者年龄分布以青少年为主,12～40岁HLA-B27阳性患者141例,阳性率为37.9%,41～78岁HLA-B27阳性患者22例,阳性率为5.99%.结论 HLA-B27阳性患者以青少年男性为主.HLA-B27检测对各种关节性疾病尤其是脊柱关节性疾病的早期诊断与鉴别诊断具有重要的临床意义.
作者单位：
广西柳州市人民医院检验科,545001
年，卷(期)：
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（请教）流式细胞的一些技术
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这个帖子发布于11年零113天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
由于本人是第一次做流式,所以请各位能帮个忙,具体步骤,我问过几个人,各人说法不一.而且查资料也是各不相同.急......
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这是在别人的实验步骤的基础上自己实践后最后总结的实验步骤，我的样本多是猕猴外周血。仅作参考。一
细胞表面标记的检测1.试剂平衡至室温。准备：消毒台面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉签，草纸和有盖垃圾桶（内装有消毒剂）。2.写编号纸并编号。1----IgG1/ IgG1/ IgG12----CD4/CD8/CD3
3----CD14/CD454----……………………3.每管加相应的抗体10μl/每种和50μl全血，震荡，室温避光20分钟。加血前摇匀血样。4.加入溶血素1ml，震荡后室温避光10分钟。5.离心，1200转， 5分钟。弃上清，震荡。6.加入PBS洗液2ml，震荡，离心，1200转， 5分钟。弃上清，震荡。7.加入PBS 900μl。上机前4度保存。8.上机。二
细胞内细胞因子的检测1.准备：消毒台面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉签，草纸和有盖垃圾桶（内装有消毒剂）。2.写编号纸并编号。
IgG1/ CD8/CD3
IFN-γ /CD8/CD33.（3－5在超净台操作）取出PMA（1∶100），BFA（1∶10）和离子霉素（1∶10），使用无菌无叠氮钠PBS稀释储存液。4.刺激：取全血或PBMCs（细胞数在0.5-1 × 106 ）50μl/管，再加入50μl RPMI1640进行稀释一倍，加入刺激剂PMA，离子霉素和BFA，混匀。最后在全血中的终浓度：PMA:50ng/ml离子霉素：1μg/mlBFA：10μg/ml。5.37℃，5% CO2 ，4小时孵育(最好用培养箱，松盖) 。6.胞外染色：各管中加入相应的表面抗体20μl和激活的全血100μl混匀，室温避光20分钟。7.溶血：每管加入溶血素2ml，室温避光10分钟。离心，1200转， 5分钟。弃上清。8.破膜通透：每管加入0.5ml通透剂，室温避光10分钟。加入2mlPBS，1000转，离心5分钟。弃上清。9.胞内染色：加入IFN-γ或IgG1的抗体20μl，混匀，室温避光30分钟。加入2ml PBS，1000转，离心5分钟，弃上清。10.加入PBS 500μl。上机前4度保存。11.上机检测。
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紫冰琳 edited on
安阳地区医院流式细胞仪操作规程所有使用流式细胞仪工作人员必须严格执行此规程规程制定者：王 升安阳地区医院流式细胞仪操作规程目录1：淋巴细胞亚群测定2：HLA-B27测定3：CD55／CD59测定4：血小板抗体测定5：红细胞抗体测定6：粒细胞抗体测定
7：白血病免疫分型测定8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定9：XL操作步骤淋巴细胞亚群测定(流式细胞仪)安阳地区医院流式细胞室操作规程文件号：2005
1日起实施第1版(共3页)
本规程每2年复审一次
复审日期：
规程编写者： 王升
批准日期：
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
淋巴细胞亚群测定(CD系列)方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：
双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。标本采集与处理
受检者的准备
检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。
静脉采血抗凝剂
EDTA或肝素抗凝血
1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若&10.0×109/L，
样本需要稀释，用PBS稀释；若&4.0×109/L，应分离单个核
4．溶血样本不能用。试剂
贝克曼库尔特成分
1：单克隆抗体
2：全血溶血试剂（1）
Optilyse C
(200 test)
5：荧光微球
BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。并做好记录。仪器
BeckmanCoulter EPICS XL样本制备：
1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入5 ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)
5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）报告结果
报告百分数（和绝对值）操作性能
批内五次重复CV&2％
500—1000个荧光素分子
参考值(百分数（绝对值）)
60.8-75.4%()
29.4-45.8%(478-1072)
18.2-32.8%(393-742)
1.05-2.03临床意义1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。临床常用Th／Ts比值来判断病人的免疫状况。Th／Ts比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。Th／Ts比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。2：NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加。方案（Protocol）
HLA-B27测定(流式细胞仪) 安阳地区
医院操作规程文件号：200 5 年 5 月 1 日起实施第1版(共3页)
本规程每2年复审一次
复审日期：
规程编写者：
批准日期：
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
HLA-B27测定方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：
双色直接免疫荧光法。将HLA-B27-FITC/B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。
标本采集与处理
受检者的准备
检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。
静脉采血抗凝剂
EDTA或肝素抗凝血
1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若&10.0×109/L，
样本需要稀释，用PBS稀释；若&4.0×109/L，应分离单个核
4．溶血样本不能用。试剂
贝克曼库尔特成分
1：单克隆抗体
2：全血溶血试剂
5：荧光微球
BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器
BeckmanCoulter EPICS XL样本制备：
1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入5 ul单克隆抗体和同型对照(IgG2a-FITC／IgG1-PE)2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)5)洗、离心、上机测样（备注： 测B27一定要至少洗一遍方可上机检测）报告结果
报告阴阳性操作性能
批内五次重复CV&2％
500—1000个荧光素分子
阳性：HLA-B27阳性而HLA-B7阳性细胞的平均荧光强度在8.0以上，而且阳性细胞所占的百分比在90%以上。
临床意义HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约KB，占人体整个基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎。方案（Protocol）
CD55/CD59测定(流式细胞仪) 安阳地区
医院操作规程文件号：200 5 年 5 月
1日起实施第1版(共3页)
本规程每2年复审一次
复审日期：
规程编写者： 王 升
批准日期：
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
CD55/CD59测定方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：
双色直接免疫荧光法。近年的研究表明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。血细胞(红细胞和白细胞)通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。
标本采集与处理
受检者的准备
检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。
静脉采血抗凝剂
EDTA或肝素抗凝血
1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。
3．溶血样本不能用。 试剂
贝克曼库尔特成分
1：单克隆抗体
2：全血溶血试剂
5：荧光微球
BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器
BeckmanCoulter EPICS XL样本制备:(一)白细胞CD55／CD59检测1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记。分别向二管中加入样品100ul。2．溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)3．离心后分别加入CD55/CD59 10ul和相应的同型对照10ul。避光20-30分钟。4．洗涤离心 5．上机测样(二)红细胞CD55／CD59检测 1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记 2．分别加入CD55／CD59 10ul和相应的同型对照10ul。 3．向二管中加入1：200稀释的样品100ul（可根据红细胞的数量调整，一般病人5ul全血加1000ulPBS稀释即可），避光20-30分钟。 4．洗涤离心。5．混匀、上机测样。
报告百分数操作性能
批内五次重复CV&2％
500—1000个荧光素分子
PNH的临界值：RBC
PNH的诊断值：RBC
大部分&80%
中性粒细胞CD59&84%
临床意义用于AA和PNH的诊断和分型诊断。PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。方案（Protocol）
血小板膜表面抗体测定(流式细胞仪) 安阳
医院操作规程文件号：200 5 年
5月 1 日起实施第1版(共2页)
本规程每2年复审一次
复审日期：
规程编写者：
批准日期：
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
血小板膜表面抗体测定方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：
直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经离心富集的血小板中，与血小板膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。
标本采集与处理
受检者的准备
检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。
静脉采血抗凝剂
EDTA或肝素抗凝血
1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内完成，冷冻的标本或已固定的标本不能用。
3．样本血小板计数应在150-450×109/L之间。若&450×109/L，
样本需要稀释，用PBS稀释；若&150×109/L，应多采集进行富集达到流式检测的细胞数。
4．溶血样本不能用。
1：单克隆抗体
2：全血溶血试剂
5：荧光微球
BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器
BeckmanCoulter EPICS XL
富集血小板法：1）800r/min*15min,取上清，2）加等量的鞘液，2000r/min*3min,弃上清，重复一次。3)分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)4)分别向试管中加入准备好的10u1含血小板的PBS（血小板的量约为106）（血小板若在正常范围，稀释到原量直接取10u1。）。5)混匀，避光，室温孵育20-30分钟6)洗或不洗，上机测样全血法：1）加4－5ml鞘液，1500r/min*15min,弃上清，后同上3）－6）报告结果
报告百分数操作性能
批内五次重复CV&2％
500—1000个荧光素分子
临床意义为免疫性血小板减少性紫癜(ITP)诊断、治疗、预后估计的重要指标，在ITP、胶原性疾病时升高。方案（Protocol）
红细胞抗体测定(流式细胞仪) 安阳地区
医院操作规程文件号：200 5 年 5 月
1日起实施第1版(共2页)
本规程每2年复审一次
复审日期：
规程编写者： 王
批准日期：
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
红细胞膜蛋白结构测定（红细胞抗体）方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：
直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到全血中，与红细胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤(和固定)等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。
标本采集与处理
受检者的准备
检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。
静脉采血抗凝剂
EDTA或肝素抗凝血
1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。
3．溶血样本不能用。试剂
1：单克隆抗体
2：全血溶血试剂
5：荧光微球
BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器
BeckmanCoulter EPICS XL操作：
1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血（1：200稀释后）。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)上机测样报告结果
报告百分数操作性能
批内五次重复CV&2％
500—1000个荧光素分子
临床意义自身溶血性贫血的分型诊断方案（Protocol）
粒细胞抗体测定(流式细胞仪) 安阳
医院操作规程文件号：200 5 年
5月 1 日起实施第1版(共2页)
本规程每2年复审一次
复审日期：
规程编写者： 王
批准日期：
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
粒细胞抗体测定方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：
直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经溶血处理后的样本中，与粒系胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析标本采集与处理
受检者的准备
检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。
静脉采血抗凝剂
EDTA或肝素抗凝血
1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。
3． 样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若&10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若&4.0×109/L，应分离单个核细胞。
4．溶血样本不能用。
1：单克隆抗体
2：全血溶血试剂
5：荧光微球
BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器
BeckmanCoulter EPICS XL操作：
1) 溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)2)分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)2)分别向试管中加入经溶血处理得样本100u1。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟，洗涤离心4)上机测样报告结果
报告百分数操作性能
批内五次重复CV&2％
500—1000个荧光素分子
临床意义白细胞减少症的分型诊断，大多数白细胞减少症患者抗体为阳性方案（Protocol）
白血病免疫分型测定(流式细胞仪)
医院操作规程文件号：200 5 年
5月 1 日起实施第1版(共3页)
本规程每2年复审一次
复审日期：
规程编写者：
批准日期：
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
白血病免疫分型测定方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：
三色直接免疫荧光法。正常血细胞的分化成熟过程中，细胞膜、细胞浆有抗原的表达与血细胞的分化发育阶段密切相关，因此这些抗原的表达与否可作为鉴别细胞和其分化阶段的基础。利用荧光素标记的单克隆抗体对血液或骨髓进行染色，通过FCM对白血病细胞细胞膜和细胞浆抗原进行分析，由此了解所测白血病细胞的系列属性及其分化程度。三色染色在白血病免疫分型中较为常用。根据分型需要，选择相应抗原的标记抗体，一般FITC标记抗体和PE标记抗体搭配为一组，再加PC5标记抗原CD45单克隆抗体，共三种抗体加入一管标本采集与处理
受检者的准备
检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血或采取骨髓液
静脉采血或取骨髓抗凝剂
EDTA或肝素抗凝血
1．样本量至少3ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本或已固定的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若&10.0×109/L，
样本需要稀释，用PBS稀释；若&4.0×109/L，应分离单个核
细胞。4．溶血样本不能用。试剂
贝克曼库尔特成分
1：单克隆抗体
2：全血溶血试剂
3：IntraPrep Permeabilization Reagent
成分1（固定剂）
成分2（透膜剂）
室温4：鞘液
6：荧光微球
BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器
BeckmanCoulter EPICS XL操作-样本制备：
细胞膜表面抗原1．首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。2．首先每管中加入5ul CD45-PC5抗体。3．然后，按管上的标记，加入相应抗体各5ul(注意：必须是FITC和PE标记的抗体搭配)4．各管中加入标本(骨髓或外周血)30～100u1(根据细胞的多少决定)，振荡混匀，室温避光20～30分钟。5．溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)细胞浆和核抗原1．准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体，其中一管是同型对照。2．首先每管中加入标本(骨髓或外周血)100ul(根据细胞的多少决定)，5ulCD45-PC5抗体。室温避光20分钟。3．每管中加入固定液100ul，剧烈振荡混匀，室温避光15分钟。4．各管中加入PBS4ml。5．300g离心5分钟后，弃去上清液，振荡混匀。(1500r/min*5min)6．各管中加入透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分钟。
7．加抗体，阴性对照管中加入5ul，其余各管加入相应抗体各5ul，室温避光15分钟。8．各管中加入4mlPBS，振荡混匀。9．300g离心5分钟后，弃去上清液。10．各管中加入PBS500ul，振荡混匀。11．上机测样报告结果
报告百分数操作性能
批内五次重复CV&2％
500—1000个荧光素分子
淋系&30%临床意义用于血液病的诊断和分型诊断方案（Protocol）T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测(流式细胞仪) 安阳
医院操作规程文件号：200 5 年 5 月 1 日起实施第1版(共3页)
本规程每2年复审一次
复审日期：
规程编写者：
批准日期：
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：
直接免疫荧光法。肝素钠抗凝全血在PMA，Ionomycin和Monensin存在下短期培养(辅助性T细胞通过细胞因子IFN-γ、IL-4的产生分为Thl、Th2两个亚群。淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子，且迅速分泌到细胞外。因此，利用刺激剂PMA+Ionomycin体外激活淋巴细胞，然后用蛋白转运抑制剂Monensin阻止细胞因子分泌到细胞外，使细胞因子在细胞内滞留到一定的量)，然后进行细胞膜表面抗原和细胞内细胞因子染色，使用流式细胞仪对CD4+细胞内的IFN-γ和IL-4进行测定。
标本采集与处理
受检者的准备
检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。
静脉采血抗凝剂
EDTA或肝素抗凝血
1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若&10.0×109/L，
样本需要稀释，用PBS稀释；若&4.0×109/L，应分离单个核
4．溶血样本不能用。试剂
淋巴细胞培养体系(自配)
成分：刺激素PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。
选白美国SIGMA公司。
单克隆抗体
CD4—PC5、IL-4-PE、IFN-γ-FITC选自美国BeckmanCoulter公司。
BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器
BeckmanCoulter EPICS XL操作：
细胞培养与染色
取200ul抗凝血加入lOul CD4-PC5单抗，室温避光孵育30分钟，RPMIl640洗涤一次，将细胞加入培养体系中，5％C02 37℃孵育18小时，取出后以PBS洗一次。用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜。将细胞分成两管，其一为测定管加入抗人IL-4-PE和IFN-γ-FITC，另一管加入同型对照，室温避光20分钟，PBS洗涤一次，待测。流式细胞仪测定
打开流式细胞仪及氩激光光源(488nm)预热20min，同时仪器自动初始化；用标准荧光微球校正光路和流路，然后依次检测标本，每份标本检测50000以上细胞，在前向散射光(FS)和测向散射光(SSC)散点图中圈定淋巴细胞群，然后分析CD4阳性细胞中IL-4-PE和IFN-γ-FITC的表达。
●淋巴细胞在FS／SSC散点图中位置，即A门内细胞；
●A门内CD4阳性细胞，即B门内细胞；
●B门内TH细胞亚群分布：
1区数值---Th 1细胞
4区数值---Th 2细胞
2区数值---Th 0细胞
(%)报告结果
报告百分数操作性能
批内五次重复CV&2％
500—1000个荧光素分子
正常参考值
Thl(IFN-γ)：17.39±5.52%
Th2(IL-4)：1.50±0.44%
ThO ：0.51±0.26% 临床意义淋巴细胞均分泌多种细胞因子：Thl细胞主要分泌IL-2，IL-12，IFN-γ和TNF-b／a等，Th2细胞主要分泌IL-4．IL-5．IL-6，IFN-γ为Thl最特异分泌的细胞因子，IL-4为Th2最特异分泌的细胞因子，所以可根据分泌的细胞因子来区分Thl与Th2。Thl为IFN-γ+，Th2为IL-4+。静息状态(人的正常生理状态、即未受到任何刺激下Th0分化为Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中仅含有极少量的Thl和Th2细胞，这时我们所能检测的胞内的IFN-γ和IL-4也微乎其微。当Th细胞受到外界因素，如刺激素、病原体等刺激，其中Th0即会向Thl或Th2大量分化，此时我们检测到的IFN-γ和IL-4也较多。本实验的检测实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反应能力。方案（Protocol）
XL 开机步骤1. 启动之前，分别将鞘液盒，清洁液盒加满、废液桶倒净。2. 开启计算机，计算机将自动进入开机程序，启动流式细胞仪。3. 打开电源箱门，检查：AIR FILTER, VACUUM FILTER 必须干燥无水WATER TRAP 液体不能超过1/3 ；VACUUM TRAP 液体若超过1/4 ，请按照SpecialProcedures and Troubleshooting 手册所示操作进行清洁4. 检查SYSTEM VACUUM 表，-17~-30 in.Hg5. 检查SYSTEM PRESURE 表，如果不在28~32 PSI 之间，请完成以下步骤将PRESURE ADJUSTER 钮拉出，调节压力至合适位置，调节钮复位，预热15 分钟，仪器提示：Insert Sample Tube。 XL 关机程序(System Ⅱ)1.完成日常清洗程序操作步骤：(1) 将漂白水与双蒸水1:1 稀释，放入12X75mm 的试管内(2) 准备3ml 双蒸水放入12X75 试管内(3) 在Acquisition 状态栏下选择PANEL-Cleaning Panel(4) 按照提示，分别将装有稀释的漂白液和双蒸水的试管依次放入样本台，上机。2.完成真空管路清洗操作步骤：(1) 按Cytometer 主机上的RUN 键，使其处于闪烁状态。(2) 将真空管洗器内加满双蒸水，放在样本台上，如此反复3次。(3) 按下Cytometer 主机的CLEANSE 键，进行清洗循环，结束后整个管道内充满清洁液。3.先用50%漂白液，之后用70%酒精清洗样本台周围，特别要注意样本台和样本针探头4.将装有2ml双蒸水的试管放在样本台上5.退出SYSTEM II 软件，按F2，按Y。在C:\XL&状态下键入“XLOFF ”6.依次关闭计算机主机，打印机，电源箱开关。注意：1. 即使每天工作24 小时，也至少要关机一次
2. 重新启动激光必须在仪器关闭30 分钟之后
3. 每2 周~4 周清洗一次空气滤膜
4. 每月清洗鞘液盒一次
5. 每60 天清洗清洁液盒一次XL 关机程序(Expo32 ADC)1.完成日常清洗程序操作步骤：(1) 将漂白水稀释(次氯酸终浓度为5%)，放入12X75mm 的试管内(2) 准备3ml 双蒸水放入12X75mm 试管内(3) 在 Resource Explorer 状态栏中点击PANEL图标并选择Cleaning Panel(4) 按照提示，分别将装有稀释的漂白液（1次）和双蒸水（3次）的试管依次放入样本台，上机。2.完成真空管路清洗操作步骤：(1) 点击工具栏中的真空管图标，这时主机上的RUN 键处于闪烁状态。(2) 将真空管洗器内加满双蒸水，放在样本台上，听到吸空的声音后再次加满，如此反复3次。(3) 按下Cytometer 主机的CLEANSE 键，进行清洗循环，结束后整个管道内充满清洁液。3.先用50%漂白液，之后用70%酒精清洗样本台周围，特别要注意样本台和样本针探头4.将装有2ml双蒸水的试管放在样本台上5.退出Expo32 ADC 软件，点击桌面上的“XLOFF ”图标，关闭主机6.依次关闭计算机主机，打印机，电源箱开关。全血标本制备o取100ul 抗凝全血加入12X75mm 试管中o加适量单抗(按抗体说明书所示)o室温避光孵育20mino裂解红细胞
Q-Prep ：直接将试管放入Q-Prep 样本台上,裂解红细胞.o在上机前加入100ul的FLOW-COUNT微球，微球要充分混匀。注:抗凝全血室温可以放置5天检测.Q-Prep标本制备仪使用方法:1.
打开仪器侧门,检查A,B,C液是否充满,如未充满,分别加入A,B,C液，关闭側门。2.
打开电源按钮。3.
打开前门，按面板上的35S CYCLE，使之显示绿色。4.
放入待溶血的标本试管，关闭前门。5.
仪器自动开始溶血，待READY灯亮后，取出试管。6.
加入下一个标本试管，重复4，5步骤。7.
制备结束后，关闭电源按钮。注：A液：甲酸、稳定剂
混匀震荡15秒B液：碳酸钠、氯化钠、硫酸钠、稳定剂
混匀震荡15秒C液：多聚甲醛、缓冲液
混匀震荡15秒质控程序一、光路与流路校准试剂Flow Check 荧光微球直径：10um光谱范围：525~700um浓度：1X106/ml保存温度：2~8 ? C变异系数(CV)：HPCV&2校准方法 1.将Flow Check 在室温下放置10 分钟
2 点击PROTOCOL，点击SELECT，选择Flow Check， 按OKAY。 3 取5滴Flow Check 放入12X75mm 的试管，加入0.5ml水，混匀。4
将试管放在样品台上进样检测，取数30005
记录FS 及荧光FL1~FL4 的HPCV 值，核对是否&2.注意若CV 值大于常规范围(&2)o按主机上PRIME 键，排除气泡干扰后重测o选择Cleaning Panel 清洗机器后重测o若以上处理均未达标，进行光路调整二、IMMUNOTROL( 类全血质控)试剂：IMMUNOTROL规格：2X 3ml保存：2~8 ? C 至效期，开启后存1 个月使用方法：取100ul 进行标记，详见全血标本制备和运行标本。作用：1. 过程与方法学质控
2. 单抗质控，对淋巴细胞表面表达的单抗进行质控外，尚可对粒细胞、单核细胞表面表达的单抗进行质控。运行标本1．
点击PROTOCOL，点击SELECT，选择PLG CD4 COUNT，按OKAY。2．
插入样本管，开始收集数据。3．
收集结束后，输入样本号。4．
插入下一个样本管，重复2，3步骤。这是我实验室的流式操作规程,有的地方可能有错误,当作一点参考吧
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