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连接酶链反应及其应用
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3秒自动关闭窗口基于连接酶链式反应（LCR）高灵敏度检测DNA甲基化--《河北大学》2015年硕士论文
基于连接酶链式反应（LCR）高灵敏度检测DNA甲基化
【摘要】：DNA甲基化是一种真核生物基因组不可缺少的表观遗传学修饰,它特异性地发生在Cp G二核苷酸的胞嘧啶上。曾有报道证实抑癌基因的非正常甲基化状态在许多疾病尤其是癌症中很常见,多与转录抑制有关系。DNA甲基化越来越多地被用作癌症检测和各种诊断的基因标志物。因此,快速、灵敏地检测DNA甲基化是非常必要的。并且,一般情况下,一种癌症会与多个Cp G甲基化相关,因此同时检测多个Cp G甲基化可以大大提高癌症检测的准确性。我们建立了两种基于连接酶链式反应(LCR)高灵敏度检测基因组中DNA甲基化的方法。第一种是LCR反应之后,扩增产物通过与纳米金上两种与产物互补的探针进行杂交反应而使纳米金之间的距离拉近,形成网状结构聚积物进而导致溶液颜色由红色变成蓝色,因此,可以通过可视化检测DNA甲基化并且通过吸收光谱对其进行定量分析。该方法可以检测低至0.01 fmol/L甲基化DNA片段和1 ng甲基化基因组DNA,在大量非甲基化DNA中可以检测到0.1%的甲基化DNA。第二种是在一条LCR探针上标记荧光基团,LCR产物通过ABI 310基因分析仪进行电泳分离和荧光检测。由于LCR可以准确区分单碱基错配,DNA甲基化检测可以获得高灵敏度和选择性。该方法可以检测低至0.01 fmol/L甲基化DNA片段和10 ng甲基化基因组DNA,在大量非甲基化DNA中可以检测出0.1%的甲基化DNA。并且,针对不同目标物,设计一个LCR探针具有不同长度,从而产生不同长度的LCR产物,经过电泳分离之后实现在一个反应体系中多个位点的同时检测。
【关键词】：
【学位授予单位】：河北大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：O629.74;O657.3【目录】：
摘要5-6ABSTRACT6-10第1章 引言10-21 1.1 DNA甲基化的分析方法10-18
1.1.1 限制性标记基因组扫描法（RLGS）10-11
1.1.2 微阵列法（microarray）11-13
1.1.3 基于甲基化敏感的限制性内切酶的单核苷酸引物延伸法13-14
1.1.4 基于亚硫酸氢钠处理的限制性内切酶分析法（COBRA）14-15
1.1.5 甲基化特异性PCR（MSP）15-16
1.1.6 甲基化荧光法（MethyLight）16-17
1.1.7 电化学发光信号放大技术17-18 1.2 连接酶链式反应（LCR）18-19 1.3 论文主要研究内容19-21第2章 基于LCR的金纳米粒子显色反应高灵敏度检测DNA甲基化21-32 2.1 前言21-22 2.2 实验部分22-25
2.2.1 仪器与试剂22-23
2.2.2. 实验方法23-25 2.3 结果与讨论25-30
2.3.1 基于LCR的金纳米粒子显色反应高灵敏度检测DNA甲基化原理25-26
2.3.2 连接温度的优化26-27
2.3.3 鲑鱼精DNA用量的优化27
2.3.4 杂交反应中NaCl浓度的优化27-28
2.3.5 检测灵敏度和选择性28-29
2.3.6 甲基化百分比检测29-30
2.3.7 人类基因组样品分析30 2.4 本章小结30-32第3章 基于LCR高灵敏度多重检测DNA甲基化32-45 3.1 前言32-33 3.2 实验部分33-36
3.2.1 仪器与试剂33-35
3.2.2 实验方法35-36 3.3 结果与讨论36-43
3.3.1 基于LCR高灵敏度多重检测DNA甲基化原理36
3.3.2 检测甲基化和非甲基化DNA的特异性36-38
3.3.3 检测甲基化和非甲基化基因组DNA的特异性38-39
3.3.4 检测甲基化和非甲基化DNA的灵敏度和线性范围39-41
3.3.5 甲基化百分比检测41-42
3.3.6 甲基化DNA的多重分析42-43 3.4 本章小结43-45参考文献45-51致谢51-52攻读学位期间取得的科研成果52
欢迎：、、)
支持CAJ、PDF文件格式
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中国期刊全文数据库
黄保法,徐俊,陆继宗,李维俭,杨涌泉;[J];上海冶金高等专科学校学报;1998年01期
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苏风霞;[D];河北大学;2015年
柏荷;[D];吉林大学;2008年
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京公网安备75号连接酶链式反应(1igase chain reaction，LCR) _答案_百度高考
连接酶链式反应(1igase chain reaction，LCR)
第-1小题正确答案及相关解析
利用耐热DNA连接酶进行DNA扩增的一种实验技术。连接酶催化与模板上相邻序列互补的两条寡核苷酸之间的连接反应。该反应使用两套引物对目的DNA连接片段退火。一对引物与一条链上毗邻的两位点退火，另一对引物与另一条链上毗邻的两位点退火。耐热DNA连接酶在相邻引物间共价连接，成为两引物之和的长引物，两条链均可发生连接反应，可产生双链产物，成为下一次反应的模板。如果在连接处有碱基错配，磷酸二酯键就不能形成，不能生成扩增产物。所以此方法在检测特定位置的突变时是特别有用的。}