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PCR实验室污染的预防与控制
发布者：：lucky 　 发布时间： ： 11:50
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PCR实验室污染的排除
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[] [] [] [] [] [] [] []请问如何消除PCR污染问题(目的基因,基因克隆,质粒,操作台) - PCR实验 - 生物秀
标题: 请问如何消除PCR污染问题(目的基因,基因克隆,质粒,操作台)
摘要: [请问如何消除PCR污染问题(目的基因,基因克隆,质粒,操作台)] 前段时间做了基因克隆，最近做定量PCR总是出现污染，具体就是我的水里也可以扩出我的目的基因，而且还比较严重，即时换了新的水也出现这个问题，估计是操作台和枪上也质粒污染了，不知道有什么办法可以彻底清除这些污染，非常着急，多谢了。 关键词:[基因克隆 目的基因 操作台 质粒]……
前段时间做了基因克隆，最近做定量PCR总是出现污染，具体就是我的水里也可以扩出我的目的基因，而且还比较严重，即时换了新的水也出现这个问题，估计是操作台和枪上也质粒污染了，不知道有什么办法可以彻底清除这些污染，非常着急，多谢了。
难道没有什么好的建议吗。把dNTP、buffer、引物、酶都更新一下试试。其实换人是最好得办法,也许是有点迷信色彩在里面.不过我一般遇到这种情况会找到另外实验室得人来帮我做,自然什么东西都用他们得,然后在自己做一次,看看究竟是什么步骤,出现了问题!有时候试验也讲运气得污染处理可按如下进行：一、环境污染1. 稀酸处理法；对擦拭试验阳性部位或器件可用lmol／L‘盐酸擦拭或浸泡，使残存DNA脱嘌呤。2．UV照射法：UV波长(nm)一般选择254／300，照射30min即可。需注意的是选择uv作为消除PcR产物残留污染的手段时，要考虑PcR产物的长度与产物序列中碱基的分布。二、反应液污染，可采用下列方法之一处理
1．DNase法：PCR混合液(不加模板和Taq聚合酶)中加入0.5U DNaseI，室温下作用30min后，加热灭活。加入模板和Taq聚合酶后进行正常PcR。DNaseI较便宜不需知道污染DNA的序列。
2．内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶(如MspI等)，最好几种合用，可克服用一种酶识别序列特异的缺陷。方法同DNaseI法，只是DNaseI由内切酶(Masp l0U)代替，作用时间延长至1h.
3．uv照射法：反应液中不加模板与Taq DNA聚合酶，注意事项与方法同上述uv照射法。
4．y线辐射法；1.5kGy的辐射可完全破坏0．1ng基因组DNA;2．0kGy可破坏104拷贝的质粒分子；4．okGy的辐射仍不影响PcR，但高于此限时会使PcR效率下降。引物可受照射而不影响PcR，y线辐射是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。希望对你有用！！（转贴，不记得从哪里来的了，个人收藏的）PCR污染与对策　　PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污 染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生.一、污染原因　　(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于 密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提 取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶 或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染.　　(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水 及其它溶液被PCR核酸模板污染.　　(三)PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR产物拷贝量 大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物 污染，就可造成假阳就可形成假阳性.　　还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩 擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样 枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由 其造成的污染是一个值得特别重视的问题.　　(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的 检验室，这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化 过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简 便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大.二、污染的监测　　一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以 便采取措施，防止和消除污染.对照试验　　1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性 对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳 性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下).但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳 性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳 定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照.　　2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:被检的标本是血清就用 鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.②试剂 对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染.　　3.重复性试验　　4.选择不同区域的引物进行PCR扩增三、防止污染的方法　　(一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定 等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开. 最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区. 其实验用品及吸样枪应专用.实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA.　　(二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题.由于操作时不慎将样品或模板核酸吸 入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸 样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染.　　(三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先 配制好，然后小量分装，-20℃保存.以减少重复加样次数，避免污染机会.另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一 冰箱.　　(四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用.　　(五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病 原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照 及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照.　　(六)减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止.　　(七)选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前 应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部.开管动作要轻，以防管内液体溅出.非常感谢大家的回答，很多事情不经历过是体会不到的，再次感谢。我还想知道，如果怀疑移液枪污染的话，怎么处理比较好啊。Bleach.楼上的意思是用含漂白粉的洗涤剂浸泡吗？
不知道一般的枪能不能浸泡在水里，我的枪是Eppdorf的。枪被污染放在紫外灯下即可我还想知道，如果怀疑移液枪污染的话，怎么处理比较好啊。可以考虑用棉花蘸1mol/l的稀盐酸轻轻擦洗。擦干之后再用无水乙醇擦一遍，晾干。污染严重时，空气中的气溶胶也是污染源。除了楼上大家提到的以外，里也有过相关讨论，你可以搜一下。
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摘要 : 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)是一种体外核酸扩增技术，它具有特异、敏感、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在几个小时内完成从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量
反转录-链反应(RT-PCR)是一种体外核酸扩增技术，它具有特异、敏感、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在几个小时内完成从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的目的产物供分析研究和检测鉴定，所以近年来被广泛应用于人和动物的多种传染病早期诊断。笔者一直从事实验室动物疫病检测工作，现就应用RT-PCR实验方法过程中出现的一些常见污染问题做如下论述，仅共同行参考和探讨。
实验有三步：提取RNA、反转录(RT)、PCR扩增及扩增产物分析，在这一过程中，最令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性。污染原因主要有以下几个方面：
1、样品间的交叉污染收集样品的容器最好使用一次性的，如重复使用，应在使用前应于180℃的高温下干烤6小时或更长时间;样品存放时要密封严实，以防外溢造成相互间的交叉污染;样品在提取过程中及吸样枪头最好使用一次性的，以免不同实验样品间相互污染;由于吸样枪污染会导致样品间的污染，也是一个值得注意的问题，由于操作不慎将样品或提取物吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取时要十分小心，吸时要慢，吸取尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染;同时要注意操作时不要剧烈地摇动反应管，开盖时也容易造成气溶胶污染。若产生气溶胶较多，会造成环境污染，不仅会导致实验失败，而且也会损害操作人员身体健康，因此每次实验完毕都要及时清理实验台面，用0.5%次氯酸钠消毒后再打开紫外灯照射半小时。
2、RT-本身使用的试剂污染在试剂配制过程中，由于加样枪、容器及其它溶液被污染。因此所有试剂都应尽量小量分装，以减少重复加样次数，避免污染机会，另外RT-PCR试剂应尽可能密封好分类存放。每次操作完毕后同样要进行台面消毒和紫外线照射消毒。
3、扩增产物的污染这是实验中最常见的问题，极微量的扩增产物污染就可造成假阳性，每次实验完后，扩增产物都要及时密封后处理。在做RT-时，一般都应设阳性对照，操作不慎，污染可能性很大，因而当某一RT-PCR试剂经自己使用稳定，检验人员经验丰富心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照，或间隔性设阳性对照，以减少污染机会。
4、操作人员污染只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，从而影响结果的准确性，RNA酶可存在操作人员手汗、唾液中，也可灰尘中，一旦器械、玻璃制品、塑料制品受到污染，容易造成实验失败，因此操作人员应戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。设置PCR操作专用实验室，所用实验用具应为专用，并合理分隔实验室，将样品的提取、配制RT-液、PCR循环扩增等步骤分室进行，实验前应将实验室及实验人员工作服用紫外线或臭氧消毒以破坏残留的DNA或RNA。任一种科学的实验方法都有其自身完善和发展的过程，RT-PCR方法也不例外，在检测质量能保证的情况下，若能简化样品提取步骤或缩短其时间，减少扩增循环次数，都能对防止污染有利。
总之，RT-PCR不管从特异性方面还是从灵敏性方面讲都具有难以匹敌的优势，结果的可靠性和可信性应该是最好的，是较具权威性的检测方法，我们期待着它能尽快地自身完善和发展。
作者：weijiali 点击：次
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