高通量测序——常用名词
1、表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）是指从不同组织来源的cDNA序列。
2、覆盖深度（coverage
depth）：每个碱基被测序的平均次数，它是评价测序量的指标之一。测序深度是指测序得到的碱基数与待测基因/转录组大小的比值；数据量的计算：基因组大小&测序深度
3、覆盖率（coverage
ratio）：指被测序的碱基占全基因组大小的比率。覆盖率随着覆盖深度升高而提高。覆盖度原来是指基因/转录组上测序测到的部分占整个组的比例
4、单核苷酸多态性(single nucleotide
polymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。
5、微卫星DNA又叫简单重复序列（Simple Sequence
Repeat，SSR），指的是基因组中由1-6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200
bp以下。研究表明，微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中。
6、Read：一次测序中仪器读取的核苷酸长度。reads不是基因基因组中的组成，实际是一小段短的测序片段，是高通量测序仪产生的测序数据，对整个基因组进行测序，就会产生成百上千万的reads，然后将这些reads拼接起来就能获得基因组的全序列了～发展到现在，高通量测序技术已经可以应用到转录组的研究，不同片段reads量（就是这些小的测序片段）不同可以代表不同的表达水平。
Contig重叠群 和Unigene非重复序列
7、nick指的是DNA双链中，一条链的断开形成的缺口，这种缺口相邻两侧裸露出游离的3端羟基和5端磷酸集团，可能是由于DNA内切酶造成的。gap指的是DNA双链中，一条链断开，并出现了核苷酸的缺失。DNA测序中位于同一染色体的两个叠连群之间中断空缺的部分。形象的翻译就是nick断开了一个点，而gap断开的是一条沟，两者的区别就是有没有核苷酸的缺失。
8、Contig：通过重叠部分将相邻reads组装形成的单元称为contigs。
9、Scaffold：利用双端测序等其他方法的信息，定位contigs在染色体上的线性排列或相对位置关系，并连接起来形成较长的scaffold序列。
10、N50：把contig或scaffold从大到小排序，并对其长度进行累加，当累加长度达到基因组序列长度一半时，最后一个contig或scaffold长度。举个例子，比如一个基因组大小是1M，测序得到若干条reads，这些reads进行拼接，如果完全可以拼接起来，中间没有gap的序列称为contig，即连续的意思。如果中间有gap,但是可以知道gap的长度，这样的序列就叫做scaffold,
即脚手架（非连续）的意思。然后把contig 和& scaffold
从长到短进行排列，然后相加，当恰好加到1M的50％，也就是500k的时候，那一条contig 或者scaffold
的长度就叫做Contig N50和Scaffold N50。很明显这个数值越大说明组装的质量越好。
11、16s rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16s
rRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长（包含约50个功能域）。随着PCR技术的出现及核酸研究技术的不断完善，16s
rRNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。数据库的不断完善，应用该技术可以实现对病原菌进行快速、微量、准确简便地分类鉴定和检测。该技术主要有三个步骤：首先是基因组DNA的获得，其次是16s
rRNA基因片段的获得，最后是进行16s rRNA基因序列的分析。
Read：高通量测序平台产生的序列就称为reads。
Contig：拼接软件基于reads乊间的overlap区，拼接获得的序列称为Contig（重叠群）。
Scaffold：基因组de novo测序，通过reads拼接获得Contigs后，往往还需要构建454
Paired-end库或Illumina
Mate-pair库，以获得一定大小片段（如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb）两端的序列。基于这些序列，可以确定一些Contig之间的顺序关系，这些先后顺序已知的Contigs组成Scaffold。
&&& Contig
N50：Reads拼接后会获得一些不同长度的Contigs。将所有的Contig长度相加，能获得一个Contig总长度。然后将所有的Contigs按照从长到短迚行排序，如获得Contig
1，Contig 2，Contig 3...………Contig
25。将Contig按照这个顺序依次相加，当相加的长度达到Contig总长度的一半时，最后一个加上的Contig长度即为Contig
N50。举例：Contig 1+Contig 2+ Contig 3 +Contig&
4=Contig总长度*1/2 时，Contig& 4的长度即为Contig N50。Contig
N50可以作为基因组拼接的结果好坏的一个判断标准。
&&& Scaffold
N50：Scaffold N50与Contig
N50的定义类似。Contigs拼接组装获得一些不同长度的Scaffolds。将所有的Scaffold
长度相加，能获得一个Scaffold
总长度。然后将所有的Scaffolds按照从长到短迚行排序，如获得Scaffold&
1，Scaffold& 2，Scaffold&
3...………Scaffold&
25。将Scaffold按照这个顺序依次相加，当相加的长度达到Scaffold总长度的一半时，最后一个加上的Scaffold长度即为Scaffold
N50。举例：Scaffold 1+Scaffold 2+ Scaffold 3 +Scaffold 4 +Scaffold
5=Scaffold总长度*1/2时，Scaffold 5的长度即为Scaffold N50。Scaffold
N50可以作为基因组拼接的结果好坏的一个判断标准。
&&& 测序深度和覆盖度：
测序深度是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。假设一个基因大小为2M，测序深度为10X，那么获得的总数据量为20M。
覆盖度是指测序获得的序列占整个基因组的比例。由于基因组中的高GC、重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖有所的区域，这部分没有获得的区域就称为Gap。例如一个细菌基因组测序，覆盖度是98%，那么还有2%的序列区域是没有通过测序获得的。
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Illumina测序平台无疑是市场上众多二代测序平台中的翘楚，高通量、高质量、低成本，操作简便，重现性好，各种好处使他的成绩在同班众兄弟中遥遥领先，公认为学霸。要想把Illumina平台用到极致，则样本的碱基平衡度是七寸和肯綮，不得不加以关注。只要把握好这一点，二代测序就能成功一大半。在影响和改善样本碱基平衡度的各种因素和途径中，barcode是重要的一环。Barcode放在什么地方好呢？一、Illumina的设计Illumina把barcode放在下游接头(adaptor)的中间。其文库结构简式如下：或者：当然也可以如下设计：式3与式1是等价的，效果一样，不作讨论。应当说这是非常科学的设计，是已有方案中最好的。优点有两个：第一，不影响有效读长；第二，不影响样本的碱基平衡度。由于barcode测序是单独、专门进行的，与read 1和read 2分开，所以不占用读长。无论read 1还是read 2，读长都不受barcode影响，100碱基就是100碱基，150碱基就是150碱基，实打实全部是插入序列，一分钱不浪费。至于barcode怎么会影响到样本的碱基平衡度，我们看了后面的设计就自然明白了。缺点有没有呢？当然有，那就是花钱比较多，试剂成本比较贵。这个缺点不是因为方案设计本身太复杂，而是因为Illumina卖价高，而且还要与建库试剂打包卖，不零售。二、常见的自定义设计为了省钱，很多人决定自己动手来设计、合成接头。还是为了省钱，自己设计的接头不得不与Illumina试剂兼容。受这样的限制，大部分barcode的位置就被设计成了这样：或者：或者：这种设计问题严重。缺点也有两个：第一，缩短了有效读长，第二，降低了样本的碱基平衡度。以式4为例，由于Illumina测序引物的杂交位点位于上游接头的3’端，read 1的测序读长就被barcode占用了一部分，有效读长变短了。Read 2的有效读长不变。假设barcode长7个碱基，read 1测序101个碱基，则有效读长就只有101-7=94个碱基。还是由于Illumina测序引物的杂交位点位于上游接头的3’端，read 1测序一上来测的就是barcode序列。如果barcode组合的碱基组成不平衡的话，全部测序数据都将受到拖累，质量降低。因为Illumina软件需要使用前4个碱基的统计数据来定位cluster，使用前25个碱基的数据来计算PF。假设barcode长7个碱基，且碱基组成不平衡，则read 1测序的cluster定位和PF计算都将受到严重影响。Barcode的碱基组成肯定要比未知样本的低。优点有没有呢？好像没有。三、自定义设计的改进自己设计barcode、自己合成接头，怎样才能避免上述弊端呢？不妨考虑以下改进措施：其中SPACER是一系列长短不等的短片段，要求做到两点：第一，长度有变化；第二，碱基有变化。比如说像下面这样的一套：NNNNNNNNNN不同的barcode配合不同长度和不同碱基组成的spacer使用，可以形成barcode被错开的效果，自然而然地增加了barcode的碱基平衡度。虽然有效读长更短了，但是后果更严重的碱基平衡度问题被解决了。考虑到Illumina软件使用前4个碱基的数据来定位cluster，spacer的最大长度为4个碱基比较好。三、PCR产物测序的改进Spacer也能用于改进PCR产物测序。PCR扩增产物(amplicon)的两端都是引物序列，如果PCR只使用一对引物，各自有大约20个碱基(PCR引物的长度)的范围内，碱基组成是极度不平衡的。由于每个位置都只有1种碱基，测序数据的质量和产量都将受到严重影响。只要在PCR引物的外侧(5'端)加上不同长度的spacer，就可以到达平衡碱基的效果，无论引物(primer)还是扩增区域(target)都被错开，即使是高度重复序列区域(比如说16S rDNA)的PCR扩增物，也能提高碱基复杂度，达到平衡，巧妙地解决了令人头疼的amplicon-seq难题。
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