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即送15丁当
细胞培养的惨痛经验教训
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每天孝敬细胞比孝敬爹妈还用心，培养细胞时有哪些惨痛经验教训可以分享呢?
　　早走早脱身，从此专注黑生物
1. 严格无菌操作，多喷喷酒精，要是对灭菌的东西不放心，自己包自己送自己烘干。
　　2. 不要和别人共用试剂耗材，自己准备一套。
　　3. 有可能的话在拿到新细胞的时候做好支原体衣原体检测。
水浴锅很脏，生化培养箱要是得手动加湿的话盘里的水也会很脏，勤换 (灭菌水加进去)。
　　5. 晚上离开的时候最好给细胞房照紫外，超净台是用完就开。
　　6. 最好的是同一时间就你一个人在用细胞房在养细胞。
　　非科班出身经验分享
　　养过一段时间的 Hela 和 Siha，都是跟别人要的，分享一点经验。
　　1. 别怕浪费。枪头什么的只要有可能污染就换，如果用酒精灯就什么都稍微烤一下，别直接放到火上，离一段距离。
动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆的气泡，动作太轻就吹不下来... 刚开始的时候吹细胞太痛苦了，稍微一下就起泡。后来就是吹的时候枪里的培养基不要一次全都压出来，留一点，枪的最头部尽量深的在液面以下。
　　3. 离开过操作台的东西再进操作台之前一定要用酒精喷一遍，包括一切实验耗材、仪器、以及你带着手套的手。
　　4. 实验结束后对实验台的消毒。紫外什么的，用前用后都照个
　　5. 身体的各个部分尽量的少接触不需要接触的地方的地方。比如实验台，又比如培养箱内部。
细胞的密度根据细胞的性质、传代的时间以及自己的心情来定。培养基的话最多最多不要超过 2 天就要换一次。细胞可以不传代，但是培养基是一定要换的。
　　大概就是，不该碰的地方不碰，有影响的地方少碰; 该使劲的时候绝对不含糊，不该使劲的地方一定忍住。如果是比较简陋的操作台就一定要摆个酒精灯，所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。如果是高级台子就多用酒精喷喷。感觉生物的实验，心疼钱就还是不要做了。
　　最后一点点绝对非科班的经验。癌细胞真是坚挺。有一次实在是不想传了，放了
5 天吧，感觉都长了几层出来，培养基都黄了。抱着试一试的心情传了一次，又坚强的活过来了。当然，状态肯定也差的很了。
　　换种心情，好好生活!
　　养了三年细胞，各种肿瘤细胞，说一点自己的看法：
　　1. 培养细胞前，可以看看细胞特点说明书，包括细胞正常生长的状态图、传代、培养基的类型等。
　　2. 不同细胞生长周期不同，有的生长很快，比如说
MDA-MB-231，传代的时候取离心悬液的十分之一就已经足够了，有的又是特别慢，等的人心焦，BT474 就是，传代是一分二，复苏起始的时候两周多才能长满，所以就要在培养细胞的过程中多多摸索了。
　　3. 对于娇弱的细胞，就得细心呵护了，胰酶消化不能过久，吹得时候要轻柔，离心时候也要注意转速和时间，每天都要去看一下细胞，肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。
　　4. 冻存细胞复苏后第二天最好更换一次培养基。
　　5. 培养箱隔一段时间彻底用酒精棉擦洗一次。
　　6. 养细胞最大的教训：不能偷懒!
　　细胞虐我千百遍，我待细胞如初恋。
不管买的细胞、惠赠的细胞，刚拿到手赶紧做两件事：检测是否有支原体污染; 迅速扩增冻存。
　　2. 发现有污染迅速处理掉，特别是当你养了很多种细胞时;
细菌污染，真菌污染很容易发现，支原体污染的话，细胞会长的慢，买个支原体检测的 kit 定期检测一下。
　　3. 细胞房日常的值日清洁是必须的，此外还要定期熏蒸。
　　4. 细胞的传代一定要规律，保持相同的
confluency 和传代时间间隔，不要随心所欲或者拖延。
　　5. 注意个人卫生。
　　靠内心感动细胞
　　1. 自己的细胞自己养，血的教训。
　　2. 在生物安全柜
(或者超净台)，枪头，血清管，血清，培养基，瓶子都足够好，并且细胞房有良好的卫生措施 (比如隔离服，手套，口罩，清洁，HEPA 等等) 且不违法操作原则的情况下，你其实很难污染。
上述条件不完备的情况下，就要多注意无菌操作了：比如要用的东西提前拿到台子里照啊 (不过这个其实也不大好，因为会挡住紫外线)，使用前 SDS+酒精擦台子，进出超净台一定要酒精擦手。
　　4. 少对细胞说话，多靠内心来感动它们 (是的!
心不诚是不可以的!) 至少 1 天看 1 次。
　　养细胞很容易
　　养细胞真的不难，最关键几点：
　　1. 所有的东西使用最好的，如果你用的血清、培养皿、培养基、胰酶什么的都是进口的，真的很难相信你会把细胞养坏。
　　2. 动作要快，胰酶消化，换液什么，细胞暴露在空气中的时间越少越好。另外，要掌握好胰酶消化时间，所谓的细胞状态差，很多时候是传代的原因。
　　3. 有时间的话，需要细胞计数，传相应数目的细胞到培养皿中，可以大致清楚细胞的生长曲线，不会临时要处理，手足无措。
　　4. 要做什么心里要非常清楚，合理安排时间，细胞房的实验穿插进行，可以节省很多时间，也不会耽误别人的实验。
　　5. 个人的实验器具自己收一套，不要和别人混用，最近换了什么新的东西稍微记一下，试剂一旦怀疑污染，马上丢。
　　6. 细胞房不能进去太多人，避免相互干扰。
　　细胞养不好，自挂东南枝
　　现在一大型药企养细胞做检测，工作量很大，很多地方都没办法非常仔细的做。但是两年下来只出现过一次污染，总结一下心得：
　　1. 好的洁净室，空调系统跟得上。
　　2. 好的生物安全柜，硬件跟的上。
　　3. 瓶子移液器吸头大都是进口，耗材跟的上。除了这些就是自己的操作习惯了。
　　4. 任何东西不要从敞开的瓶口上面经过。
　　5. 虽然酒精灯会干扰安全柜气流但是还是需要一盏用来勤烧瓶口。
　　6. 实验时所用材料的位置摆放要顺手，污染源和已灭菌物品要分开放置。
　　养细胞就像打仗
　　细胞饲养涵盖的内容太广了，而且不同种类细胞的饲养难度以及技术要求不同，肿瘤细胞，成纤维细胞，上皮细胞...
甚至各类干细胞... 每一种都有自己的生长要求。如果只是单纯的一般性操作，大同小异，个人觉得练好技术的情况下注意几点就好:
各种无菌，从培养基到操作过程再到培养箱，时刻注意无菌。本人曾经所在的实验室出现过大规模污染并最终导致所有细胞集体毁灭... 教训惨痛。
　　2. 培养基的配制一定要做好梯度摸索并详细记录，否则细胞死都不知道怎么死的。
　　3. 尽量提高操作熟练度，减少培养皿在培养箱外的滞留时间，细胞很脆弱，经不起折腾，不像人，热了有空调，冷了能烤火。
　　4. 把握好培养基更换的时间，不同细胞类型时间不同，早了浪费试剂，晚了可能全军覆没。
　　5. 经验很重要，养细胞的很多经验你是无法在公开的书籍和资料上找到的。多向实验室前辈学习，他们会让你少走很多弯路，真
　　养细胞就像打仗，知彼知己，百战不殆。只有了解你养的对象，才能把他养好。
　　细胞就是矫情
　　养细胞细胞这个东西呢有的时候真说不清。养过一段时间的巨噬细胞，一开始操作各种谨慎小心，随时默念各种无菌原则，培养基什么的都用的进口的，其实国产货真的不差，有钱就是任性!
但细胞还是萎靡不振，两个多星期过后实在懒得管，换液等操作也很随意的草草进行，酒精也懒得喷，结果这货却开始疯长，过了几天居然达到一天要传一次代，而且数量甚至可以一传三， 所以说，有的细胞就是矫情。
不知道邀请谁？试试他们
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嗯嗯，受教了。零零散散说了这么多，请问你培养细胞有操作手册什么的吗？
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细胞种类很多，具体可以查文献，简单说个常规细胞培养方法：初代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒初代消化培养法1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
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养细胞真要上心
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刚刚开始养细胞的新手，污染一次细菌，传代后不死也不长一次，感觉还是要多做，总结经验。
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受教，我给我同学要了marc145养的很好长得很好，由于需要回趟老家让同学帮忙养，结果全部完蛋了，我就重新复苏，养了一周多才彻底恢复，但细胞大小不一，还有点脏乱的东西飘着，完全没了原来的样子
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我养的巨噬细胞，确实很矫情
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楼主好善良，都是些细节性的注意事项，要是我刚养细胞就能看见就好了，反正刚养的时候污染过一两次，被导师鄙视后，真的就是仔细，不要偷懒，细胞就好好的了。巨噬细胞也养过，速度真的是！而且很容易被刺激到···
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请教楼主，支原体怎么见检测？如果已经支原体污染，有什么特征性表现？怎么处理？有什么补救吗？
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丁香园准中级站友
楼主写得真好，最近在养肿瘤细胞，看实验记录前人从没记录过出什么问题，可我复苏了两个细胞系，一开始因为死细胞比较多，头两天每天换液，不过因为接种密度大（3×10^6到 6孔板的2个孔），贴壁还是接种后第二天就到80-90%左右，然后就1:3传代了，结果就发现长势很慢，越来越慢，中间还试着提升了FBS浓度到15%，感觉稍好转后又换回10%的，然后支撑了2周左右，不到20%……想请教楼主@：1. 是否我传代时接种太稀了（因为以前养别的肿瘤细胞系，1:5,1:6都长得很快，以为刚复苏的也没问题）。2. 换液、传代、来回更换不同浓度FBS培养基太频繁，可能刚复苏的细胞并不喜欢换液太频繁，不过也有战友告诉我刚复苏的最好天天换液。3. 换液总是会吹打出很多气泡，不吹打的话这种细胞很容易抱团，也怕细胞分布不均（有的地方＞90%不传代也不利，可周围大片地方都只有30%左右），请问如何浆细胞铺均匀？如何避免吹打出过多气泡？4.
在细胞生长不均匀的时候，如的地方＞90%不传代也不利，可周围大片地方都只有30%左右，如何判断融合率及传代时间？很矛盾啊，谢谢楼主！
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丁香园准中级站友
也欢迎其他战友提供经验、指正！很着急，细胞都养不好如何开展后续试验，头大如斗
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想请教楼主@：1. 是否我传代时接种太稀了（因为以前养别的肿瘤细胞系，1:5,1:6都长得很快，以为刚复苏的也没问题）。2. 换液、传代、来回更换不同浓度FBS培养基太频繁，可能刚复苏的细胞并不喜欢换液太频繁，不过也有战友告诉我刚复苏的最好天天换液。3. 换液总是会吹打出很多气泡，不吹打的话这种细胞很容易抱团，也怕细胞分布不均（有的地方＞90%不传代也不利，可周围大片地方都只有30%左右），请问如何浆细胞铺均匀？如何避免吹打出过多气泡？4.
在细胞生长不均匀的时候，如的地方＞90%不传代也不利，可周围大片地方都只有30%左右，如何判断融合率及传代时间？很矛盾啊，谢谢楼主！1，Some kinds of tumor cell lines are density-dependent, especially at a poor state.2, Generally, changing culture condition frequently is harmful to cells.
When the backgroud of cells observed under the microscope is dirty, for example, there are
some death cells, you can change the medium at a short time.3, You can properly extend the digest time to avoid the accumulation of cells. For 10cm dish or 6-well plate, suggest you shake up by hands. As for 12, 24-well plate, suggest you disperse cell uniformly by
blowing the medium a few times after inoculation.4,
To perform passage mainly according to the area with the highest density.
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丁香园准中级站友
感谢@版主拨冗回答，很有帮助！
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关于丁香园细胞消化后老是离心不下来，为何(细胞消化,胰酶) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 细胞消化后老是离心不下来，为何(细胞消化,胰酶)
摘要: [细胞消化后老是离心不下来，为何(细胞消化,胰酶)] 这几次用0 4%胰酶和0 4%的EDTA消化细胞后，离心2000转5分钟后，细胞老是离不下来且细胞呈絮状，请高人指点 关键词:[细胞消化 胰酶]……
这几次用0.4%胰酶和0.4%的EDTA消化细胞后，离心2000转5分钟后，细胞老是离不下来且细胞呈絮状，请高人指点
回复胰酶浓度好像有点高啊，我们是0.25%的消化，你是不是消化过头了还有离心的转速好像有点高啊，一般都是800转的，超过1500转对细胞就有损害了，不过不同的离心机这个略有差别还有就是中液体过多，也不容易把细胞离下来另外还有个传代不用离心的方法，我们这边用的很好，省事也省时，对细胞也较好，就是胰酶消化20S（不同的细胞时间上会有差别），然后倒掉胰酶，然后再放置20s或者是拍打培养瓶使细胞脱落，当所有的细胞都脱落后，加培养基中和掉反应，分瓶子、传代。由于瓶子里残留的胰酶很少，在有的培养基中也发挥不了作用，所以他的影响可以忽略不计了
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电话：021-请问细胞培养几个问题，谢谢(细胞培养,移液管,培养基,温度) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 请问细胞培养几个问题，谢谢(细胞培养,移液管,培养基,温度)
摘要: [请问细胞培养几个问题，谢谢(细胞培养,移液管,培养基,温度)] 本人是新手，刚开始养细胞，碰到一些小问题，望大家指点，谢谢！1、滴管、移液管吸了培养基之后，过会儿还要再吸培养基，一般怎么搁置滴管、移液管？2、在培养瓶、离心管中吹打细胞很容易产生气泡。查了一下《细胞培养》的书提到吹打的时候尽可能不要出现气泡，气泡对细胞有损伤。该怎样避免气泡？另外在离心管中吹打产生气泡，会不会影响随后细胞计数的准确性？3、离心时1000rpm，6min，温度应该设置为多少度？（本 关键词:[细胞培养 培养基 移液管 温度 细胞计数 培养瓶]……
本人是新手，刚开始养细胞，碰到一些小问题，望大家指点，谢谢！1、滴管、移液管吸了培养基之后，过会儿还要再吸培养基，一般怎么搁置滴管、移液管？2、在培养瓶、中吹打细胞很容易产生气泡。查了一下《细胞培养》的书提到吹打的时候尽可能不要出现气泡，气泡对细胞有损伤。该怎样避免气泡？另外在中吹打产生气泡，会不会影响随后细胞计数的准确性？3、离心时1000rpm，6min，温度应该设置为多少度？（本人培养MCF-7细胞，查了参考书，没提到温度）4、细胞计数时：观察到有3个细胞连在一起，此时应该计算为1个细胞，还是3个细胞？若观察到有几个细胞连在一起（但没办法数到具体几个细胞），是不是就当作一个细胞。
1、一般有吸管架，将尽量靠近胶头侧放置在架上。或者我们也常常将放在培养瓶里，但不要碰到培养液 ，因为培养瓶是倾斜放置的，所以可以保证吸管放在培养瓶而不至于进入培养液。2、尽量避免气泡是当然的，在吸管头侵入液面以下前，最好保证能把吸管内的气体排尽，然后尽量使动作缓慢一些。3、离心的温度问题这个应该看具体的实验而定，一般都设定在4度，不过您的文献上没有提到的话，应该是没有特殊要求，常温就可以的。4、细胞团在一起的话，都算一个细胞，不过这只建立在成团细胞比较少的情况下，否则认为没有吹打均匀，最好将细胞吹打均匀后重新计数。回复本人最近也养了细胞 ，谈谈自己的心得吧 ，希望共同提高 1. 我这里没有架，而且也是自己操作，没有助手，一般我是先将所需水吸到细胞瓶，之后配哪个液体就将吸管放在哪个瓶内，吸头没入液面的话（小心不要吸入液体）。2.我减少气泡的方法是在液面下吹打液体，就是将吸头没入液面以下轻轻吹吸，但每次都不要将吸管内的得液体出吹尽，留一点（约0.5毫升吧）就不会产生气泡了。温度如上所说，没具体要求4度就行吧，就说这些希望对你有帮助回复谢谢各位指教！回复为了方便操作,我们实验室一般是用试管架,然后在架子上放洗净并高压灭菌的试管来放用于吸取培养液的滴管;关于吹打细胞起泡现象,一般吹打时动作温柔些,吹打速度慢点就会减少很多气泡了啊回复说说我们这里的方法：1、我们实验室在吸取培养基之后的或者是尖吸管，如果是需要有放下的需要的话，我们就直接放到废液缸中，在本次试验中不在使用。因为如果是要放到培养瓶中的话，万一你的某一个培养平在操作中不慎出现了污染的情况，那么就会导致你很多的培养瓶都被污染。2、在吹打的过程中起气泡的问题，我们通常是注意在吹打的过程中，力度要轻柔，不要过于猛烈，那样对于细胞不好，而且容易起气泡。而且在排出液体的时候可以贴壁。还有就是，在每次吹打的时候，尖吸管中的液体不要全部都排光，在尖端要留一点，这样的话气泡就会少。3、在离心时的温度，如果细胞没有特别的说明，那么常温离心就可以了。4、计数的问题，我同意求学路漫漫的方法（细胞团在一起的话，都算一个细胞，不过这只建立在成团细胞比较少的情况下，否则认为没有吹打均匀，最好将细胞吹打均匀后重新计数。 ）回复1 在本次实验中只用一次2 气泡问题不是很大 我的经常有 3 传细胞就2点
消化时间 和污染
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一般操作：戴一副橡胶手套就可以了，戴两副手套则手指头不方便出力。培养液按说明书讲是要避光的，但从4摄氏度冰箱拿出来一起照台，刚好温度升上去，而且紫外线不透塑料，所以就拿去照吧。胰酶也说要4摄氏度保存，但同样存在一个升温的问题，尤其是胰酶的最佳消化温度，所以也拿去照台。细胞就不要拿去照台了，也不喷酒精，以免倒置显微镜下看不清楚，沾湿的瓶口也更容易沾上脏东西。照台前，先往超净台喷一遍酒精，放完物品可以再喷一次。照完台，关紫外灯，开白灯，开风机，最低档风速即可，戴上手套，手套喷酒精，操作前，先点酒精灯，再用酒精纱布擦擦台面，擦完的干净台面上可以放瓶盖，瓶盖凹面不能向上，能侧放最好，不行的话就将瓶盖盖在干净的台面上。开小培养瓶的瓶盖，可以手掌小鱼际固定、压住平放的培养瓶瓶身，拇指和食指拧开瓶盖，达到单手操作的效果，拧上的时候也一样。滴管不用的时候最好夹在无名指和中指之间，保持水平，避免污染。开盖后的培养瓶，不要竖立，往培养瓶中加液体时拿着培养瓶也是斜放。滴管的液体尽量避免沾到瓶口，因为血清的存在所以完全培养基会产生气泡，滴管不要排空就不会把滴管内的气泡带入培养瓶或沾在滴管口，滴管口不沾气泡则在出瓶口时不容易沾到瓶口。滴管出瓶口的时候，要快进快出，要悬着一个念头，念头悬着进而注意力更集中、动作更快。
离心：细胞离心应选择较低的转速，避免对细胞的物理损伤，个人习惯用1000r/min，一般离心5分钟。
复苏：先让水浴锅的温度达到37摄氏度左右，从低温区取出冻存的细胞后马上投入水浴中。复苏的关键是快速解冻。将冻存的细胞吸到离心管中，加入一定量完全培养液后离心，是为了去除冻存液中的DMSO。直接吸取1ml冻存液到25平方厘米的培养瓶中，再加完全培养基到5ml，则DMSO的终浓度为2%，这个浓度的DMSO还是会在一定程度上抑制细胞生长。不经过离心去除DMSO，不是说一定不可以，只是后果自负。
换液：当培养液变黄时，说明细胞生长旺盛，一定要换液，快长满了就传代或冻存。当培养液较脏时，比如漂浮较多死细胞，一般出现在复苏或传代后的第二天、以及常规生长细胞的第二三天，也要及时换液。
洗细胞：当培养瓶中出现较多死细胞、细胞碎片或其他杂质时，就要清洗一下。但注意用吸管加入PBS或生理盐水时，要对着培养瓶侧壁，以免冲刷掉瓶底的部分细胞。加入PBS或生理盐水后，盖上盖子，在台面上摇晃几下，注意不要把液体溅起来或沾到培养瓶顶面。能用PBS洗最好，虽然PBS的主要成分是氯化钠，但具有pH缓冲作用。用无菌生理盐水洗细胞也可，优点是比较便宜。
消化：个人经验是先摸时间，一劳永逸，以后对于同一种细胞到时间了就赶紧加完全培养基终止消化。一般消化2分钟就行了，在此基础上增减消化的时间。也有人建议在倒置显微镜下观察，等大部分贴壁细胞收缩后就停止消化，但个人认为这是多此一举，而且很难把握一个度。吹打细胞要有节奏，动作要熟练，吸的时候要在液面下吸，吹的时候要对着瓶底没液平的地方吹，吸的时候不要吸到气体、吹的时候不要吹入液体平面下，这样就基本不会产生气泡。
传代：常用1:2传代，这样才有足够的细胞密度。不离心再重悬细胞，虽然避免了离心和重悬对细胞的损伤，减少了几个步骤，减少污染，但吸掉胰酶的中和液后很容易丢失一部分细胞，甚至丢失大部分细胞，对于初学者不太适用。刚传代的细胞，若在倒置显微镜下观察到分布不均匀、有细胞团，就要及时晃匀。
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