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这个帖子发布于5年零297天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
做了好多次HBV intermediates的southern blot，以前在1.5kb和3.5kb左右会出现2条条带。使用的probe是前辈留下的，大约700kb。抗体是mono clone的HBcAb。vector是pcDNA3，长度为5.3kb,插入HBV长度为4.4kb，plasmid全长9.7kb.最近自己重新制备了probe后（制备的protocol与原先的相同），1.5kb和3.5kb的条带消失，取而代之的是9kb和比10kb还要长的两条条带出现。先前以为出现的条带是HBV复制时使用的的模板DNA或者RNA，现在出现了10kb左右的条带，不解这两条条带的意义。请高手指点迷津。
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In the present Southern blot picture, could you indicate the DNA markers and samples in each lane? Could you show UV picture of the DNA digestion gel, the one that you ran the Southern blot?If enzymes that you have used to cut your DNA samples are different from enzymes other people used previously, the Southern blot would show different bands.
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For the he upper picture, lane 1 & 12 are 1kb ladder with fragment ranging from about 0.5 kbp to
10 kbp counting from the left side. Lane 2 & 11 are HBV markers, while I don't know the length of the fragments exactly. Lane 3 to 10 are HBV intermediates that are purified by deproteinization and ethanol precipitation after immuno-precipated by HBcAb. There is little intermediates detected. I guess it was because copies of HBV samples were too low or something went wrong with my probes.Another question, I did not prepared probes for the 1kb ladder, but the fragments of the ladder did show clearly. How could cross-hybridization be so strong？For the lower picture, lane 1&10 are HBV markers counting from the left side. And lane 2 to 9 are HBV intermediates treated in the same way mentioned above.Here is the UV picture for the gel before transfered to a nylon membrane by vacumm.
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In the present Southern blot picture, could you indicate the DNA markers and samples in each lane? Could you show UV picture of the DNA digestion gel, the one that you ran the Southern blot?If enzymes that you have used to cut your DNA samples are different from enzymes other people used previously, the Southern blot would show different bands.
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小弟最近在做southern blot，用的是试剂盒DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ ,具体操作如下：1用试剂盒里面的随机引物，酶（HaeIII)切后的基因组DNA为模版进行探针合成。2通过抽滤将酶（HaeIII)切后的基因组DNA附在NC膜上，80度固定2h。3预杂交30分钟，加入探针1微克（探针的终浓度为23微克/毫升），过夜杂交。4洗膜（2乘SSC-SDS洗两次，0.1乘SSC-SDS洗两次，马来酸洗一次）5封闭6加入抗体7用WASHING BUFFER(马来酸加0.3%的吐温20）洗两次8detection buffer平衡5分钟9显色曾尝试过用试剂盒里面的control DNA进行实验，按照说明书的要求做，能做到1pgDNA出现显色反应，单独将探针固定在NC膜上也可以出现显色反应。但是一用到酶（HaeIII)切后的基因组DNA就做不出来，而且不是一两次的事了........希望各位走过路过的大虾们能给与意见和建议，万分感激！！！！！
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Could you answer the following questions for your Southern blot experiments? How did you prepare the genomic DNA samples? Is there any picture showing your uncut genomic DNA samples? How many microgram of DNA did you use in the Hae III digestion? And how it is look like on the gel? How big the probe DNA is? And where should the probe be complementary to the region of the gene to be detected?
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mpark Could you answer the following questions for your Southern blot experiments? How did you prepare the genomic DNA samples? Is there any picture showing your uncut genomic DNA samples? How many microgram of DNA did you use in the Hae III digestion? And how it is look like on the gel? How big the probe DNA is? And where should the probe be complementary to the region of the gene to be detected?首先谢谢您的问题。我的基因组DNA是直接从BL21(DE3)中直接提取出来的，但是提取完之后没有经过电泳观察，只进行了紫外分光测定浓度（浓度只有90ng/微升），之后直接进行酶切处理。至于用HaeIII酶切，体系如下：10乘NEB缓冲液5微升，DNA20微升，酶1微升，用三蒸水补足至50微升。37度过夜。酶切完后进行了纯化处理，并测定其浓度为63ng/微升，但还是没有进行电泳观察。至于探针，我是用试剂盒中的随机引物进行合成的。曾尝试在NC膜上只加引物，然后固定，加抗体，显色.......稀释十万倍的引物也能有明显的显色（但此过程是没有经过杂交的）。
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Can you show the map in which where the probe DNA finds its way in the complementary DNA?The other issue is that you need to run digested DNA on the gel and take picture to determine if the DNA is fine (no degradation) or not, and the DNA concentration is enough or not. Moreover, you need to know if Hea III digestion works or not.
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mpark Can you show the map in which where the probe DNA finds its way in the complementary DNA?The other issue is that you need to run digested DNA on the gel and take picture to determine if the DNA is fine (no degradation) or not, and the DNA concentration is enough or not. Moreover, you need to know if Hea III digestion works or not.OK,thank you !I will try it.......
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你好，问一下，你们质粒做过Southern blot，质粒还需要酶切吗？
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心心de 你好，问一下，你们质粒做过Southern blot，质粒还需要酶切吗？有，我们一般都是经过酶切的，相对来说酶切过后效果会好一点
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心心de 你好，问一下，你们质粒做过Southern blot，质粒还需要酶切吗？质粒不酶切的话会出现多条带，酶切以后就只有单一条带，便于观察和分析看你的具体需要再决定是否酶切吧。
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【求助】southern blot 阳性对照有条带，转基因的没有
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各位大虾好，我现在正在做southern 杂交，用的是罗氏的盒子，质粒的量是20 ng，DNA提取是用的莱枫的，我用PCR验证了转基因苗，设计了两对引物，重复性很好，并且做了下半定量，基因表达也有很明显的提高，可是做Southern杂交时却没有条带，背景很好，探针也检测了效果都不错，请问会不会是基因组DNA的量不够呀？下面特贴上基因组DNA酶切图片，望指点一.二
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上样多少阿？质粒加那么多干嘛，不到一纳克足够
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上样量2ug左右吧，因为DNA浓度不够，我想问下DNA提取用哪个公司试剂盒比较好点，我想必须先保证DNA的量够
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问罗氏的技术支持好了，
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楼主，你好 ，最近我也一直在做southern DIG，也是只有阳性对照，我想问一下你酶切了多久？
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我也是新手，我只是觉得你右半边的酶切效果不太好，另外你DNA 的量也不够
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你可以采用CTAB法大提DNA
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关于丁香园小木虫 --- 500万硕博科研人员喜爱的学术科研平台
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Southern blot实验求助
请问有没有人用Roche的试剂盒DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II检测过人类基因组DNA外源基因的单拷贝插入？看了很多文献用的都是同位素，最近做了两次都没有结果，细胞基因组20ug，500微升酶切体系，用HindIII酶切过夜后加醋酸胺乙醇于-80度沉淀过夜后离心，75%乙醇洗一遍后溶解DNA上样，50V跑胶约4hr后盐酸脱嘌呤，变性，中和后，20XSSC 转膜过夜。第二天下午紫外交联后50度预杂交30min后杂交过夜，探针制备是用的490bp的模板，浓度是25ng/mL, 杂交管中杂交过夜，目的条带大约是4kb, 但最后曝光片子上只能看到marker的条带，压片过夜也是如此，还请做过的人多多指教，谢谢！
就是普通的毛细管法，用吸水纸和重物，转膜缓冲液是20XSSC
就是人基因组啊，用的是293T细胞
估计是细胞含量的问题，你提取的量达不到杂交的要求。我最近讲一个视频会涉及到各种southern的问题
你好，请问视频在哪里可以观看呢？？
实验一直没有结果~比较急，谢谢！
你留下你的邮箱 我晚上发给你
十分感谢！
能不能给我也发一份，，非常感谢！
你好！我看了您发的视频，有几个问题还想请教：
最近我分别用两个探针杂了同一张膜，两个探针GC含量差不多，是用罗氏试剂盒随机引物法标记，第一个探针490bp, 第二个探针750bp, 杂交温度都是42度，第一个探针能杂出单一条带，但是第二个探针杂出来就是一片弥散的黑，降低探针浓度之后也是同样的结果，像酶切后跑胶的结果，没有条带，正对照有条带，请问到底是什么原因？杂交温度？探针浓度？谢谢！
你杂交的时候是分布杂交的还是同时杂交的？
我是一张膜先用第二个探针杂交，然后洗掉探针再用第一个探针杂交的
你用NBT显色的？
不是，是用CSPD曝光的
那只能是你的杂交膜不太合适的 你用的肯定是GE公司的
Hybond-N+,确实是GE的，那为什么同一张膜一个探针杂出来是好的，另外一个不行呢？
LZ能不能把视频给我发一份了，最近一直做southern，没有结果，需要学习！谢谢！邮箱：
请问能否也发我一份呢，邮箱，非常感谢！
你好，我最近也在做southern，能否发我一份，
研究生必备与500万研究生在线互动！
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