ins64.tmp.exe 是什么东西啊 突然弹出来说是病毒
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ins64.tmp.exe确实是一种病毒，建议使用杀毒软件进行查杀。
是一种病毒，伪装成.tmp临时文件。 杀毒软件有提示就把它杀掉吧！
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病毒消除 Gerblins!
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突变型人胰岛素原基因的克隆及其腺病毒载体的构建
□ 石琳 陈振萍 袁向飞 杨少光 张宇光 韩忠朝
中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院,天津300020
摘　要:目的：构建含有定点突变的人胰岛素原基因的腺病毒表达载体。方法：首先利用RT-PCR方法从正常流产胎儿胰腺组织获取野生型人胰岛素原cDNA；然后通过重叠延伸PCR方法在人胰岛素原cDNA上产生2个突变位点，使突变的cDNA编码的蛋白质含弗林蛋白酶的识别位点，该突变型胰岛素原cDNA片段命名为INS-M2；最后将INS—M2亚克隆至腺病毒载体系统的穿梭载体的多克隆位点上，并与骨架载体共转染至细菌内，通过细菌内同源重组得到重组载体。结果：HindⅢ和XhoⅠ酶切、PacⅠ酶切及测序均证实载体pAd-INS-M2构建成功。结论：构建的含定点突变人胰岛素原基因腺病毒载体pAd-INS-M2为进一步转染非胰岛β细胞，对糖尿病进行基因治疗奠定了基础。
作者单位：中国医学科学院【摘要】&
构建含有定点突变的人胰岛素原基因的腺病毒表达载体。方法: 首先利用rt?pcr 方法从正常流产胎儿胰腺组织获取野生型人胰岛素原
然后通过重叠延伸pcr方法在人胰岛素原cdna 上产生2个突变位点, 使突变的cdna编码的蛋白质含弗林蛋白酶的识别位点, 该突变型胰岛素原cdna片段命名为ins?m2;
最后将ins?m2亚克隆至腺病毒载体系统的穿梭载体的多克隆位点上, 并与骨架载体共转染至细菌内, 通过细菌内同源重组得到重组载体。结果:
ⅲ和xho i 酶切、
pac i酶切及测序均证实载体pad?insm2构建成功。结论: 构建的含定点突变人胰岛素原基因腺病毒载体pad?ins?m2为进一步转染非胰岛β细胞, 对糖尿病进行基因治疗奠定了基础。
【关键词】& 胰岛素原 腺病毒载体/padeasy?1 弗林蛋白酶
　　糖尿病已成为仅次于心脑血管病症和癌症的第三大致死疾病, 胰岛素是治疗糖尿病的主要药物, 但由于随时需要注射胰岛素,& 给患者带来了极大的不便, 对糖尿病的基因治疗成为了可能。随着分子生物学领域取得的迅猛发展, 特别是重组dna 技术的建立［1］, 我们通过重叠延伸pcr技术对胰岛素原基因进行2个位点的突变, 将人胰岛素原基因cdna 上b?c链连接处的碱基序列lys thr arg arg 及c?a链连接处的leu gln lys arg分别突变为arg thr lys arg及arg gln lys arg序列, 以使其可以被弗林蛋白酶识别［2］。然后将突变型的人胰岛素原基因构建到腺病毒载体中, 使其有望成为糖尿病基因治疗理想的候选载体之一, 并为进一步进行人胰岛素原基因转染非胰岛&细胞, 使之产生胰岛素治疗糖尿病奠定基础。
　　1& 材料和方法
　　1．1& 材料&
　　pcr产物胶回收试剂盒、 限制性内切酶hind ⅲ、& xho i、& probest dna聚合酶、 simple t vector、 dna marker均购于大连宝生物公司;& t4 dna 连接酶、 m?mlv逆转录酶购于invitrogen公司;& 限制性内切酶pme i、 pac i购于neb公司;& 质粒dna 抽提试剂盒购于
赛百盛;& 引物由上海生物工程有限公司合成;&& padeasy?1载体系统、 dh5&菌株、 bj5183菌均由血研所中法实验室保存。
　　1．2& 方法
　　1．2．1& 引物设计
　　根据genbank发表的人胰岛素原基因cdna序列, 综合利用primer5和oligo6引物设计软件设计人胰岛素原基因全长的引物, ins1: 5&?gct& ctc gag& gcc acc atg gcc ctg tgg at?3&;& ins2: 5&?gag& aag ctt& gct gcg tct agt tgc agt agt?3&, 划线部分为酶切位点（xho i 和hind iii）。再根据pcr定点突变原理, 分别在人胰岛素原基因b?c链及c?a链连接处进行2次突变, 突变引物设计如下:& ins3: 5&?ttc ttc tac aca ccc cgg acc cgc?3&;& ins4: 5&?gcg ggt ccg ggg tgt gta gaa gaa?3&;& ins5: 5&?gtc ccg
gca gaa gcg tgg cat tgt?3&;& ins6: 5&?aca atg cca cgc ttc tgc cgg gac?3&;& 斜粗体划线部分为突变的位点。
　　1．2．2& 野生型人胰岛素原基因的获得&
　　取胎龄5个月的经水囊引产的健康胎儿胰腺组织, 液氮中冷冻过后用depc处理过的研钵研磨, 然后加入trizol抽提总rna, 以提取的总rna经逆转录后合成的cdna为模板, 以引物ins1和ins2进行pcr反应。反应条件: 94℃, 预变性5& 变性、退火及延伸条件分别是94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共进行30次循环;& 最后72℃延伸10 min。pcr产物经10 g/l琼脂糖凝胶电泳鉴定。
　　将pcr 产物克隆至t载体上进行筛选、 扩增及鉴定, 并送测序公司测序。
　　1．2．3& 突变型人胰岛素原基因的获得&
　　采用重叠延伸pcr 法, 使人胰岛素原基因产生两处突变。以获得的野生型人胰岛素原基因为模板, 首先进行b链/c肽连接处的突变。用引物ins1、 ins4和引物ins3、 ins2分别扩增出两段pcr产物, 利用引物ins3和ins4的互补部分使这两段pcr产物互为模板和引物, 在dna聚合酶的作用下延伸出整条人胰岛素原基因, 然后再加入引物ins1和ins2继续扩增含有第一个突变的人胰岛素原基因（命名为ins?m1）, 将扩增产物连接到t载体中, 并送测序公司测序鉴定。第二处突变在c肽与a链的连接处。以经测序第一处突变改造成功的人胰岛素原基因为模板, 用引物ins1、 ins6和引物ins5、 ins2经过以上同样的方法诱导产生含有第二个突变的人胰岛素原基因（命名为ins?
m2）, 将扩增产物连接到t载体中送测序公司测序鉴定。
　　1．2．4& 穿梭腺病毒载体的构建&
　　将腺病毒穿梭质粒padtrack?cmv和突变型人胰岛素原基因（ins?m2）分别用hind ⅲ和xhoⅰ双酶切, 纯化
、 回收双酶切产物进行连接, 连接反应条件为ins?m2双酶切产物5 &l、& padtrack?cmv双酶切产物3 &l、& buffer& 1 &l、& t4 dna连接酶1 &l,& 16℃& 16& h, 连接产物命名为padtrack?ins?m2, 转化dh5&感受态细胞, 铺板、& 挑菌、 摇菌、 提取质粒,& hind ⅲ、 xho
ⅰ酶切鉴定。
　　1．2．5& 重组腺病毒载体的构建&
　　先把bj5183细菌用氯化钙法制备成感受态, 将腺病毒骨架质粒padeasy?1转化到bj5183感受态细胞中, 铺板
、 挑菌、 摇菌后再用同样的方法制备成感受态细胞。然后padtrack?ins?m2被限制性内切酶pmeⅰ线性化, 再经碱性磷酸酶ciap处理后, 转化入含有腺病毒骨架质粒padeasy?1的bj5183感受态细胞中去同源重组。经过铺板、 挑菌、 摇菌、 提取质粒等步骤获得重组质粒pad?ins?m2。经hind ⅲ、& xhoⅰ和pacⅰ酶切鉴定。
　　2& 结果
　　2．1& 野生型人胰岛素原基因的扩增
　　利用设计的人ins的特异性引物, 以正常流产胎儿胰腺组织总rna为模板, 采用rt?pcr的方法, 扩增出人 ......(未完，请点击下方“在线阅读”)
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金月芽期刊网 2018免责声明：本视频来自自媒体，不代表腾讯网的观点和立场。取消Ins上被赞爆的12款澳洲美食，你造吗？
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