急急急！western blot pvdf膜如何保存 - 实验交流 - 生物秀
标题: 急急急！western blot pvdf膜如何保存
摘要: [急急急！western blot pvdf膜如何保存] 本人做WB最后结果是用ECL检测的，但由于仪器设备损坏当天无法拍照。目前还未加显色液，不知如何保存已经孵育好的膜，请高手指教，最多能保存几天？很着急，多谢了！ 关键词:[孵育]……
本人做WB最后结果是用ECL检测的，但由于仪器设备损坏当天无法拍照。目前还未加显色液，不知如何保存已经孵育好的膜，请高手指教，最多能保存几天？很着急，多谢了！
请大家看完不要走，留点意见，再次感谢！听别人说将膜甲醇浸泡10s后干燥冷存（-20°）可以保存两个月，我已经冷冻干燥了，但是人家说的是没加抗体孵育的膜，我的膜已经做完所有处理了，就差显色拍照了，不知道能不能用这个方法，或者是不是冷冻后要重新抗体孵育再显色呢？谢谢谢谢！
如果不能用ECL得到结果的话那么用DAB显色可以吗？我的蛋白是250KD的，不知道具体要怎么做呢？从来没做过，请高手指点下，最好能是详细的操作步骤，试剂什么的都要，有相关资料的共享下吧，非常感谢！
如果是湿膜的话，直接放四度，一两个星期没有问题，用时直接加显色液就行了，冷冻干燥后，问题不会太大，如果不放心的话，拿出来重新封闭一下在用二抗作用一段时间。用DAB显色和ECL是一样的，可以用ECL试试，不行在用DAB.
先谢谢楼上的了，我一直用的是ECL，这次是因为仪器坏了所以没办法。我还想问下，那干燥就是放滤纸上风干吗？是不是一会就好了，我就是放在滤纸上风干的，可能不到五分钟吧就感觉干了，然后是包在滤纸里放-20°的，不知道对不对呢？麻烦楼上的好心人再回答下吧！呵呵
干燥时最好先用甲醇湿润下。空气中自然风干。甲醇挥发很快，整个过程也就持续十分钟左右。5分钟时换一下滤纸，防止膜和滤纸粘连。干燥后用滤纸包好，最好存放在-70冰箱中，据说可存放半年以上。-20也可以，时间短一点
好的，万分感谢！
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【求助】PVDF膜如何做点杂交
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最近做western，总是不出结果。看了论坛不少帖子提到了蛋白质点杂交，也想试一试，看看目的蛋白表不表达目的蛋白。但有几点不明白，步骤中提到了把膜烘干，包括加样前和加样之后烘干，有室温晾干10min，也有放烤箱的。但是之前一直听实验室的师兄说膜千万不能干。我用的是PVDF膜，晾干会不会影响结果呢？膜要怎么处理？关于样品。有的说是不用煮沸和加loading buffer 直接点在膜上就可以了。有的说要。样品该如何处理？急盼有做过的大侠指点一二！查看完整版本请点击这里：
popo520 ( 12:37:39)
protocol 用的都是 NC膜。PVDF膜不行吗？
qianqin1977 ( 12:39:05)
1 western 蛋白是通过加热煮沸和loading buffer 中SDS变性的，当你试图通过点杂交来摸索条件或看看是否有目的蛋白时也应该向 western一样处理。
2 膜是这样的当你点上样品后要烘干，目的是使蛋白固定在膜上，在随后的过程中，加一抗以后就不能干了，否则非特异性会非常高
3顺便说一下，pvdf膜与nc膜各有优劣，都能用，但选择时要根据目的蛋白的大小来选。（膜孔径）
gmjghh ( 12:39:52)
目的蛋白表不表达目的蛋白,SDS-PAGE 就可以看得出来。
还有免疫印迹不出结果主要看你表达出的是可溶性蛋白？还是包涵体蛋白？再就是一抗是否效价高或纯都有关系。
popo520 ( 12:40:20)
按照4楼朋友的说法pvdf膜与nc膜都可以。怎么2楼朋友给出的哈佛的protocol里面还强调了 (NOT PVDF!) 还用感叹号，是不是不能用PVDF膜只能用NC膜?新生小白。望大家赐教！
mysmdbl ( 12:40:38)
NC膜是亲水的，PVDF膜是疏水的。
2楼提供的方法是将蛋白溶液直接点在膜上并干燥。NC膜可以用这种方法固定蛋白，而PVDF膜由于不亲水，蛋白水溶液是固定不上的，你自己可以试试，非常明显。
当然，如果用电转将蛋白转到PVDF膜上就没什么问题了。
owanaka ( 12:40:56)
点膜我这边玩过很多次， PVDF，PSQ和NC膜都是可以的。 只不过前两个用之前都要用甲醇泡一泡活化一下，泡后马上转到PBS中，准备好样品，再把膜从PBS里提出来放在湿滤纸上，沥干膜表面的水，就可以点蛋白了，点一点上去，等它干得差不多了可以再点一点，全部点完后，晾干，烘干，烤干都可以。 干后再你用常用的方法封闭，后面的过程注意不要干了，干了就容易产生很重的背景。 至于NC膜就不用这麻烦了，拿起来就直接点样，点完后的过程和前面一样了。
fsdd817 ( 12:41:34)
做过一次点杂交，就是用的PVDF膜，用之前活化，点蛋白时候小心，点一点，晾干，再点。点尽量小。然后接着WB做就行了。
查看完整回复请点击这里：pvdf膜是什么材料做的
PVDF:&Polyvinylidene&fluoride,&&&&&&&&&&&&IUPAC&name:&poly-1,1-difluoroethene&&&&&&&&&&&聚偏二氟乙烯分子式：-(C2H2F2)n-
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扫描下载二维码如何重复利用PVDF膜？ - 实验交流 - 生物秀
标题: 如何重复利用PVDF膜？
摘要: 如何重复利用PVDF膜？网上说PVDF膜可重复利用，不知应怎样做，请高手指教？ 关键词:[可重复]……
网上说PVDF膜可重复利用，不知应怎样做，请高手指教？
可重复利用是指做过western之后的膜通过煮膜的办法去除结合的抗体，然后用其他抗体标记再做免疫印迹。
经过这种处理后，对膜的结合率不会影响嘛？
Stripping and Reprobing for Western Blot Buffers:Erasure Buffer: 2% (w/v) SDS , 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 at 20°C), 100 mM b-mercaptoethanol.TS Buffer: 10 mM Tris-HCl (pH 7.4 at 20°C), 150 mM NaCl.Blocking Solution: 5% (w/v) nonfat dry milk in PBST BufferProtocol: After performing chemiluminescent western blot development and film exposure:1.Strip antibodies by incubating blot for 30-90 minutes at 50°C in Erasure Buffer.2.Wash 2 times, 10 minutes each wash, in PBST Buffer.3.Block for 2.5 hours in Blocking Solution.4.Incubate with new primary and secondary antibodies.5.Wash three times with appropriate wash solution after each antibody incubation.6.React 1 minute with LumiGLO&O Chemiluminescent Substrate.7.Expose to X-ray film for desired amount of time and develop.
高！本人觉得如果两个目的片段的分子量相差比较大(&10KD）可以直接加入第二种抗体，效果还可以。本人最多在一张膜上做过8个抗体，中间只Striping了一次，超爽。
请问楼上的兄弟怎样做的，在下佩服之至，愿闻其详。向您取经。我做的目的片段相差11kD，我一直用洗膜的方法做两次，浪费时间。不过我的Marker只有荧光才能显现出来。用考马斯亮蓝染不出。
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