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d-二聚体与转移癌的关系及在口腔肿瘤中的展望
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血浆D一二聚体测定结果是1.07它的参考范围是0.00到0.5...
血浆D一二聚体测定结果是1.07它的参考...
病情描述（发病时间、主要症状、症状变化等）：血浆D一二聚体测定结果是1.07它的参考范围是0.00到0.50这个结果对身体危害有多大曾经治疗情况和效果：有时候会呼吸困难，查的是心脏血医生就说有可能是栓想得到怎样的帮助：就是想知道这个结果对身体影响有多大
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因不能面诊，医生的建议仅供参考
职称：主治医师
专长：内科
&&已帮助用户：154890
问题分析：你好！根据你的描述可能是身体有栓塞性疾病的危险性导致的上述标志物升高。意见建议：建议注意休息，不做剧烈活动，建议做肺和心脏有关检查排除栓塞性疾病，建议过段时间后复查。
问心脏方面问题
职称：医生会员
专长：消化道、呼吸道、
&&已帮助用户：340543
你好朋友，这种情况建议你去医院检查一下心电图，排除一下心脏病的可能，确诊后再治疗。祝您健康！
问你好…我最近总是上不来气……感
职称：医生会员
专长：胃、十二指肠溃疡，复合性溃疡，幽门管溃疡
&&已帮助用户：17808
问题分析：你好；根据你上面所说的情况和病情的症状的表现，这应考虑是心脏和支气管炎导致的症状的表现的意见建议：建议；可以去医院内科检查下的，这样有助于治疗和诊断病情的
问检查心脏大。上不来气，诊断为心衰。应该怎么样治疗呢...
职称：医师
专长：肝胆疾病、冠心病
&&已帮助用户：22444
问题分析：你好，根据你的描述，心衰的话需要综合治疗，需要采取端坐位、吸氧治疗，使用强心、利尿、扩血管药物和活血化瘀药物治疗。意见建议：建议患者平时不要过度劳累，不要生气、饮酒等，注意预防感染，还要定期复查心脏彩超。心衰目前还不能彻底治愈，只能是药物治疗延缓病情进展。
问心脏疼上不来气要憋死了
职称：医师
专长：高血压，胃肠疾病
&&已帮助用户：20493
病情分析： 朋友你好，你这情况建议你检查心电图看看，如果存在ST段压低就可能是心肌缺血导致的心绞痛了。意见建议：平时要注意饮食，六个字，低脂肪高纤维。情绪上要注意不要大喜大悲，保持充足睡眠。养成良好生活习惯，定时排便，不能过度劳累。
问上不来气心脏有问题吗
职称：医生会员
专长：手足癣,传染性软疣,白驳风
&&已帮助用户：398110
你好，初步认为和心脏疾病有关系，需要进一步的检查，明确病因及早治疗.不要盲目用药,以免加重病情,多喝水.不应作剧烈运动，忌吃辛辣食物，并保持睡眠充足，舒缓压力.
问心脏病,爱累，上不来气
职称：医师
专长：肿瘤和脑血管病
&&已帮助用户：158176
这位朋友你好！根据口述，不能做出明确的诊断，把进期的心电图检查结果或图片传上来，为你分析一下。
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【求助】SDS-PAGE显示“共价二聚体”形式分析求助
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这个帖子发布于5年零345天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
近期纯化一蛋白时发现一怪现象，SDS-PAGE电泳时有一条分子量为目标蛋白两倍的条带，含量占主带1%-2%。该条带经WB和质量肽图分析，确认为相关蛋白；还原前后仍存在，暗示该条带与二硫键无关，应为共价偶联形成的二聚体条带。3D结构显示一单体的N端与另一单体的C端距离很近，有很强的相互作用，怀疑为N端NH2与C端COOH偶联所致；但该条带在水溶液放置过程中慢慢增多，理论上讲在水溶液中COOH很难和NH2形成酰胺键，只有在缩合剂DCC，DIMP等存在下才可催化此类反应，但储存溶液中无此类物质，难以解释；故怀疑为蛋白N端与C端超强非共价作用力（离子键、氢键、疏水作用力等共同作用）所致，但理论上讲SDS可以破坏此类作用力，即使不能破坏，该条带也应该恒定，而不应随着放置时间的延长而逐渐增多。该条带含量极少，手头所有的纯化方法均不能有效将其与主带分离，只能通过制备型SDS-PAGE电泳的方法慢慢收集，切胶时已确保收集条带无单体蛋白干扰，但通过切胶收集的二聚体条带重新电泳后竟重新出现单体条带，其含量与多聚体条带含量各占50%。该条带颇诡异，请大家一同分析！
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eastrocket 还原前后仍存在火箭兄的意思是说分别做过还原型和非还原型的SDS-PAGE？这种情况我确实也遇到过的，对此也曾做过一些思考。以前做过原核表达的IFN-gama，最后产品的电泳即有此现象。这是一个正式生产的药用蛋白，通过了各种报批审核，所以是与试验条件无关，是客观存在的。而Human IFN-γ分子中无Cys，所以IFN-γ这种SDS-PAGE表现出来的二聚体、三聚体肯定是与二硫键无关。乙肝表面抗原（HBsAg）电泳也常见此现象。印象中重组人TNF（肿瘤坏死因子）也是有此现象的。我不同意火箭兄例子“共价二聚体”的说法。我瞎猜猜看，夹杂着做一些假说来讨论。蛋白中存在着二硫键、非二硫键、杂合三种多聚体，这些多聚体在一定程度上与单体蛋白间形成一个聚合和分离的动态平衡。而聚合的作用力可能方式多样，聚合反应的平衡常数因聚合类型和蛋白种类而异。二硫键多聚体很好理解。在还原型SDS-PAGE中，这种多聚体可以认为完全打开。非二硫键多聚体有些复杂。虽然在绝大多数蛋白电泳的表现中，它可以打开，但是我认为达不到全部，或者说会受到动力学方面的限制。在电泳中，打开这种多聚体的力就是SDS。SDS作为表面活性剂，很有效地对付蛋白质中的疏水作用，但不是万能。打个比方，无论那一种商品化的蛋白质提取试剂，（也就是一些含有表面活性剂、变性剂、还原剂、螯合剂、抑制剂等的缓冲溶液），都不能将一块组织中的所有蛋白溶解提取出来。这里面有作用力方面的原因，也有动力学的因素。蛋白质的相互作用，并非那么单一。火箭兄的例子，我想做这样一个假说解释。1、原始样品中有单体，也有非二硫键形式的二聚体（应该也有三聚体、四聚体等，只是量少，检测不到）。2、这种二聚体并非共价型的，它和单体间相互移动平衡。在不同的体系中，平衡会移动。例如水溶液中，二聚体会增多。慢慢增多的现象是受到动力学的制约。3、SDS不能将这种二聚体完全打开。初始样品电泳表现为1-2%。4、制备电泳切胶获得的虽然当时全部是二聚体，但是在提取后，在溶液中新的平衡形成，二聚体部分转化为单体。或许是受到动力学的制约，电泳表现为50%。5、大胆预测1：制备电泳获得的纯单体蛋白，重新电泳，也会有二聚体条带出现。6、大胆预测2：制备电泳获得的单体及二聚体蛋白，如果放置时间足够长，使得平衡完全，那么，它们的电泳行为应该很接近，二聚体的比例恒定。很好的话题，其它请各路好手讨论。
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好久不见火箭兄了，应skykiller兄邀请来学习这个帖子；“SDS-PAGE电泳时有一条分子量为目标蛋白两倍的条带，含量占主带1%-2%”，“还原前后仍存在，暗示该条带与二硫键无关”；质量肽图分析确认为相关蛋白，考虑二聚体。虽然还原后这条带仍存在，但我想知道，还原电泳和非还原电泳时这条带的含量有没有实质性的改变？ 我的理解是没有，因为后来火箭兄说了该蛋白单体之间无二硫键，仅仅通过疏水作用力聚合在一起。根据火箭兄的描述：1）3D结构预测显示单体的N端与C端之间有很强的相互作用力；2）尿素、盐酸胍等强变性剂都试过，“二聚体”仍然存在； 3）在水溶液放置过程中，“二聚体”含量有所增加。说明这个作用力很不容易打开，但很容易形成的，这是很矛盾的；酰胺键绝对不可能在这样的条件下形成。另外还有2个问题，1）变性后纯单体蛋白重新电泳，没有二聚体带形成，说明变性剂还原剂对这个作用力是有影响的；2）3聚体4聚体能打开，为什么2聚体打开不完全？不知道这个蛋白的具体信息，比如PI？有没有做过NATIVE电泳？等等我觉得1%-2%并不是个很大的量。以前实验室有做个四聚体蛋白WB的，确定是通过二硫键形成，但是不管加多少量的DTT，在二聚体和三聚体位置总是有条带曝出来。加上火箭兄所说“二聚体条带重新电泳后竟重新出现单体条带”，似乎又与前面的观点相反---这个力是容易被解聚的。所以我觉得可以把二聚体蛋白单独拿出来，再试试变性剂和还原剂，说不定有意想不到的发现。个人比较倾向多聚体未完全打开的观点。另外火箭兄关心的是什么力让这两个单体聚合在一起，不是二硫键，不可能是酰胺键，如果是是氢键或疏水键的话，应该能被变性剂打开，所以只能用打开不完全来解释，生化方面的再具体我就发表不上意见了。老朋友见面高兴，胡言几句，别拍砖，呵呵:D
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iris_palm edited on
eastrocket 近期纯化一蛋白时发现一怪现象，SDS-PAGE电泳时有一条分子量为目标蛋白两倍的条带，含量占主带1%-2%。该条带经WB和质量肽图分析，确认为相关蛋白；还原前后仍存在，暗示该条带与二硫键无关，应为共价偶联形成的二聚体条带。您是说经过Mass Spec分析对吧？二聚体不一定非要共价结合的哦。除了二硫键外，其它相互作用如果很强的话SDS也打不开。比如吧，你查查LamB，在SDS PAGE中trimer，但3-D结构中没有共价键；我手头有一个蛋白， 在SDS-PAGE中是trimer。这个蛋白是个突变体，几个氨基酸突变后就形成稳定trimer，而Wild type蛋白在SDS-PAGE上是monomer，但做cross linking时可以看到trimereastrocket wrote:3D结构显示一单体的N端与另一单体的C端距离很近，有很强的相互作用，怀疑为N端NH2与C端COOH偶联所致；但该条带在水溶液放置过程中慢慢增多，理论上讲在水溶液中COOH很难和NH2形成酰胺键，只有在缩合剂DCC，DIMP等存在下才可催化此类反应，但储存溶液中无此类物质，难以解释；故怀疑为蛋白N端与C端超强非共价作用力（离子键、氢键、疏水作用力等共同作用）所致，但理论上讲SDS可以破坏此类作用力，即使不能破坏，该条带也应该恒定，而不应随着放置时间的延长而逐渐增多。感觉是time -d 你下面提到可溶性比较差，可能形成了比较强的疏水作用力。比如很多膜蛋白，一加热，就形成多聚体，即使SDS-PAGE上也能看到。或者时间长了，高浓度等等，都能形成非特异多聚体。不过一般会看到oligomer，仅仅dimer的少。eastrocket wrote:该条带含量极少，手头所有的纯化方法均不能有效将其与主带分离，只能通过制备型SDS-PAGE电泳的方法慢慢收集，切胶时已确保收集条带无单体蛋白干扰，但通过切胶收集的二聚体条带重新电泳后竟重新出现单体条带，其含量与多聚体条带含量各占50%。该条带颇诡异，请大家一同分析！如果是稳定的dimer，在gel filtration上应该可以分开；否则就是SDS变性使得形成部分多聚体。如果回收后的条带跑出monomer和dimer，请问上样量是否一致？如果您做一个梯度浓度的话会不会看到dimer随浓度增高而增高？有的Cys-disulfide 很强。有报道需要50 mM DTT才能打开的，但那一般是natural的而不是非特异的。如果怀疑N端相互作用可以考虑做个truncation。总之，我的看法是：蛋白放长时间了形成multimer是比较常见的。如果您认为这个值得研究或者这个dimer影响你的结晶或者别的实验呢，应该考虑把原因找出来，然后解决。否则要看您的时间和兴趣了。供您参考。
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火箭兄试验室条件不错啊~~3D结构是做的什么得到的结论？水溶液？应该不是纯水吧，是什么缓冲液？通过你试验结果看单体和二聚体应该是保持在某一平衡？该蛋白天然情况下是否存在多聚体？另外你应该是做得基因工程获得的重组蛋白吧，N端或C端加了什么修饰？有没有加什么tag？
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eastrocket 还原前后仍存在火箭兄的意思是说分别做过还原型和非还原型的SDS-PAGE？这种情况我确实也遇到过的，对此也曾做过一些思考。以前做过原核表达的IFN-gama，最后产品的电泳即有此现象。这是一个正式生产的药用蛋白，通过了各种报批审核，所以是与试验条件无关，是客观存在的。而Human IFN-γ分子中无Cys，所以IFN-γ这种SDS-PAGE表现出来的二聚体、三聚体肯定是与二硫键无关。乙肝表面抗原（HBsAg）电泳也常见此现象。印象中重组人TNF（肿瘤坏死因子）也是有此现象的。我不同意火箭兄例子“共价二聚体”的说法。我瞎猜猜看，夹杂着做一些假说来讨论。蛋白中存在着二硫键、非二硫键、杂合三种多聚体，这些多聚体在一定程度上与单体蛋白间形成一个聚合和分离的动态平衡。而聚合的作用力可能方式多样，聚合反应的平衡常数因聚合类型和蛋白种类而异。二硫键多聚体很好理解。在还原型SDS-PAGE中，这种多聚体可以认为完全打开。非二硫键多聚体有些复杂。虽然在绝大多数蛋白电泳的表现中，它可以打开，但是我认为达不到全部，或者说会受到动力学方面的限制。在电泳中，打开这种多聚体的力就是SDS。SDS作为表面活性剂，很有效地对付蛋白质中的疏水作用，但不是万能。打个比方，无论那一种商品化的蛋白质提取试剂，（也就是一些含有表面活性剂、变性剂、还原剂、螯合剂、抑制剂等的缓冲溶液），都不能将一块组织中的所有蛋白溶解提取出来。这里面有作用力方面的原因，也有动力学的因素。蛋白质的相互作用，并非那么单一。火箭兄的例子，我想做这样一个假说解释。1、原始样品中有单体，也有非二硫键形式的二聚体（应该也有三聚体、四聚体等，只是量少，检测不到）。2、这种二聚体并非共价型的，它和单体间相互移动平衡。在不同的体系中，平衡会移动。例如水溶液中，二聚体会增多。慢慢增多的现象是受到动力学的制约。3、SDS不能将这种二聚体完全打开。初始样品电泳表现为1-2%。4、制备电泳切胶获得的虽然当时全部是二聚体，但是在提取后，在溶液中新的平衡形成，二聚体部分转化为单体。或许是受到动力学的制约，电泳表现为50%。5、大胆预测1：制备电泳获得的纯单体蛋白，重新电泳，也会有二聚体条带出现。6、大胆预测2：制备电泳获得的单体及二聚体蛋白，如果放置时间足够长，使得平衡完全，那么，它们的电泳行为应该很接近，二聚体的比例恒定。很好的话题，其它请各路好手讨论。
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SmallDonkey 火箭兄试验室条件不错啊~~3D结构是做的什么得到的结论？水溶液？应该不是纯水吧，是什么缓冲液？通过你试验结果看单体和二聚体应该是保持在某一平衡？该蛋白天然情况下是否存在多聚体？另外你应该是做得基因工程获得的重组蛋白吧，N端或C端加了什么修饰？有没有加什么tag？呵呵，我们实验室条件非常一般，有一些实验是委托别人做的。本来想直接用晶体结晶X衍射的方法拿到它的真正的3D结构，但是无奈该蛋白溶解性极差，各种缓冲都实验了，仍然无法得到结晶。目前的3D结构是通过同源建模构造的，虽然某些氨基酸的位置与实际的结构有些偏差，但是N端与C端的大体位置和相互作用力还是能较准确反映实际情况的。我的蛋白天然情况下是多聚体，单体之间无二硫键仅仅通过疏水作用力缔合在一起；在多聚体情况下，一单体的N端与另一单体的C端靠的很近，3D结构显示有很强的相互作用力；这种二聚体的形成为活性形式（可以和亲和层析填料结合），存在于多聚体内部，只是对现有多聚体结构起到了加固的作用，对多聚体结构功能无任何改变；我们的蛋白是重组蛋白，N端和C端无任何修饰，N端测序显示实际结果与理论序列完全一致；而且我纯化到了少量天然组织中存在的这种蛋白，天然提取蛋白SDS-PAGE显示仍然含有该条带，含量与重组蛋白相当；因此，推测这种结果绝非偶然，应该是具有一定的生物学作用的（如稳定四聚体结构等）。
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我的觉得问题的关键是什么“力”使单体蛋白聚合成二聚体。至于为什么不是三聚体四聚体或者有但含量低，暂不作考虑。“3D结构显示一单体的N端与另一单体的C端距离很近，有很强的相互作用”这个3D结构是测的单体的还是二聚体的？这不是问题的关键，随便问问。1.二聚体条带随着放置时间的延长而逐渐增多。增加到多少的时候不再变化？这个楼主可以试试。2.“但通过切胶收集的二聚体条带重新电泳后竟重新出现单体条带，其含量与多聚体条带含量各占50%”根据这个条件我猜测在溶液中二聚体增加到与单体各占50%时不再增多。3.“通过制备型SDS-PAGE电泳的方法慢慢收集，切胶时已确保收集条带无单体蛋白干扰，但通过切胶收集的二聚体条带重新电泳后竟重新出现单体条带”通过这条推断，SDS无法阻止单体向二聚体转换，也无法阻止二聚体向单体的逆向转换，所以SDS不是阻止这个“力”的合适试剂。相互作用的力嘛，我猜可能是N、C端羟基羧基的相互作用，也可能是附近的氨基侧链相互作用，第二条是瞎猜的，没看过有相关报道。接下来的实验建议：1.用电泳测定在溶液中二聚体最终会增加到多少浓度。单体聚合成二聚体也是个反应，所以该看看这个反应的结果如何，多长时间达到平衡完成反应。进一步实验可以研究其他条件对反应时间甚至反应平衡结果的影响。2.用不同的试剂阻止单体向二聚体聚合，这是关键了。除了SDS，巯基乙醇、DTT、Triton、吐温、尿素、盐酸胍、硫酸铵、甚至有机溶剂等。某种试剂阻止了聚合才好判断是什么力让单体聚合的。核磁或者其他检测手段都不能判断结合的位点在哪里是吧？这个不了解。知道了结合的位点才是根本地解决了这个问题。对聚合体蛋白了解不多，凭自己想象乱说几句，呵呵祝顺
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skykiller 火箭兄的意思是说分别做过还原型和非还原型的SDS-PAGE？这种情况我确实也遇到过的，对此也曾做过一些思考。以前做过原核表达的IFN-gama，最后产品的电泳即有此现象。这是一个正式生产的药用蛋白，通过了各种报批审核，所以是与试验条件无关，是客观存在的。而Human IFN-γ分子中无Cys，所以IFN-γ这种SDS-PAGE表现出来的二聚体、三聚体肯定是与二硫键无关。乙肝表面抗原（HBsAg）电泳也常见此现象。印象中重组人TNF（肿瘤坏死因子）也是有此现象的。我不同意火箭兄例子“共价二聚体”的说法。我瞎猜猜看，夹杂着做一些假说来讨论。蛋白中存在着二硫键、非二硫键、杂合三种多聚体，这些多聚体在一定程度上与单体蛋白间形成一个聚合和分离的动态平衡。而聚合的作用力可能方式多样，聚合反应的平衡常数因聚合类型和蛋白种类而异。二硫键多聚体很好理解。在还原型SDS-PAGE中，这种多聚体可以认为完全打开。非二硫键多聚体有些复杂。虽然在绝大多数蛋白电泳的表现中，它可以打开，但是我认为达不到全部，或者说会受到动力学方面的限制。在电泳中，打开这种多聚体的力就是SDS。SDS作为表面活性剂，很有效地对付蛋白质中的疏水作用，但不是万能。打个比方，无论那一种商品化的蛋白质提取试剂，（也就是一些含有表面活性剂、变性剂、还原剂、螯合剂、抑制剂等的缓冲溶液），都不能将一块组织中的所有蛋白溶解提取出来。这里面有作用力方面的原因，也有动力学的因素。蛋白质的相互作用，并非那么单一。火箭兄的例子，我想做这样一个假说解释。1、原始样品中有单体，也有非二硫键形式的二聚体（应该也有三聚体、四聚体等，只是量少，检测不到）。2、这种二聚体并非共价型的，它和单体间相互移动平衡。在不同的体系中，平衡会移动。例如水溶液中，二聚体会增多。慢慢增多的现象是受到动力学的制约。3、SDS不能将这种二聚体完全打开。初始样品电泳表现为1-2%。4、制备电泳切胶获得的虽然当时全部是二聚体，但是在提取后，在溶液中新的平衡形成，二聚体部分转化为单体。或许是受到动力学的制约，电泳表现为50%。5、大胆预测1：制备电泳获得的纯单体蛋白，重新电泳，也会有二聚体条带出现。6、大胆预测2：制备电泳获得的单体及二聚体蛋白，如果放置时间足够长，使得平衡完全，那么，它们的电泳行为应该很接近，二聚体的比例恒定。很好的话题，其它请各路好手讨论。“非二硫键多聚体有些复杂。虽然在绝大多数蛋白电泳的表现中，它可以打开，但是我认为达不到全部，或者说会受到动力学方面的限制。”这个也是目前我认为最有可能的结果，只是没遇到过其他例子，现在看这种现象应该是较普遍的，即SDS-PAGE无法完全打开某些强非共价作用力结合在一起的蛋白，让其被误认为是共价形式二聚体。这个可能是我们目前SDS-PAGE的一个限制，也许在这方面综述中，国外大牛应该会有较详细论述，近期我会查阅一下相关文献。有了新的进展，会与大家汇报。5、大胆预测1：制备电泳获得的纯单体蛋白，重新电泳，也会有二聚体条带出现。由于SDS-PAGE电泳后蛋白变性为单体，这时单体间N端和C端距离很远，这种相互作用力已消失，因此我们收集的单体蛋白条带中无二聚体条带。6、大胆预测2：制备电泳获得的单体及二聚体蛋白，如果放置时间足够长，使得平衡完全，那么，它们的电泳行为应该很接近，二聚体的比例恒定。电泳制备的缺点就是破坏了天然构想，打破了这种平衡，现在正在再次确认二聚体条带是否可向单体条带转化，目前正将同一样品反复收集，在确保无单体条带干扰的情况下，看这种二聚体向单体的转换是否存在
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yianvv 我的觉得问题的关键是什么“力”使单体蛋白聚合成二聚体。至于为什么不是三聚体四聚体或者有但含量低，暂不作考虑。“3D结构显示一单体的N端与另一单体的C端距离很近，有很强的相互作用”这个3D结构是测的单体的还是二聚体的？这不是问题的关键，随便问问。1.二聚体条带随着放置时间的延长而逐渐增多。增加到多少的时候不再变化？这个楼主可以试试。2.“但通过切胶收集的二聚体条带重新电泳后竟重新出现单体条带，其含量与多聚体条带含量各占50%”根据这个条件我猜测在溶液中二聚体增加到与单体各占50%时不再增多。3.“通过制备型SDS-PAGE电泳的方法慢慢收集，切胶时已确保收集条带无单体蛋白干扰，但通过切胶收集的二聚体条带重新电泳后竟重新出现单体条带”通过这条推断，SDS无法阻止单体向二聚体转换，也无法阻止二聚体向单体的逆向转换，所以SDS不是阻止这个“力”的合适试剂。相互作用的力嘛，我猜可能是N、C端羟基羧基的相互作用，也可能是附近的氨基侧链相互作用，第二条是瞎猜的，没看过有相关报道。接下来的实验建议：1.用电泳测定在溶液中二聚体最终会增加到多少浓度。单体聚合成二聚体也是个反应，所以该看看这个反应的结果如何，多长时间达到平衡完成反应。进一步实验可以研究其他条件对反应时间甚至反应平衡结果的影响。2.用不同的试剂阻止单体向二聚体聚合，这是关键了。除了SDS，巯基乙醇、DTT、Triton、吐温、尿素、盐酸胍、硫酸铵、甚至有机溶剂等。某种试剂阻止了聚合才好判断是什么力让单体聚合的。核磁或者其他检测手段都不能判断结合的位点在哪里是吧？这个不了解。知道了结合的位点才是根本地解决了这个问题。对聚合体蛋白了解不多，凭自己想象乱说几句，呵呵祝顺呵呵，两种蛋白之间确实存在一种联系。但是有一点我没有跟大家讲清楚。这个蛋白活性形式是多聚体，多聚体情况下好像单体可以慢慢向多聚体转换，但是SDS-PAGE胶回收时，已将蛋白变性，打成单体，即便回收回来，单体仍然无法形成多聚体活性形式，这种关系已打破，单体无法继续向二聚体转换，但是，二聚体好像可以逐渐断裂成单体（目前结果显示），据此判断，这种二聚体应该不是共价作用力形成。3D结构检测的是多聚体结构，多聚体中包含有这种二聚体异构，3D结果显示一个单体的N端与另一个单体的C端平行排布，有10多个氨基酸可以相互作用，这种作用力应该是很强的。单体向多聚体转换，何时达到平衡这个我们没有仔细研究过，只是在放置的过程中发现二聚体含量略有增多。其他的如尿素、盐酸胍等变性剂和还原剂都实验过，上述二聚体仍然存在，有机溶剂和其他的去垢剂倒没有实验过，后期会尝试一下。目前我的重点确实是判断结合位点在何处。通过质量肽图分析多聚体条带和单体条带，根据酶切肽段差异，并结合分子量应能判断结合位点，这也是我用SDS-PAGE胶回收纯化二聚体条带的目的，但是目前没有得到纯度足够高的二聚体条带，目前这个方法也正在实验！
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这个现象的确很有意思，如果确认那条条带是目的蛋白质，则无疑是个二聚体。如何连接在一起的呢？我也赞成这楼上各位最后总结认为 “非二硫键多聚体有些复杂。虽然在绝大多数蛋白电泳的表现中，它可以打开，但是我认为达不到全部，或者说会受到动力学方面的限制。”。另外在 Methods in Molecular Biology （Vol 1 , page 53）的一篇文章里有写，我更觉得，那是极有可能的事情。fault:
Bands have become smeared or streaked.cause:
Proteins in the sample are insoluble or remain aggregated in the sample solvent.remedy:
Use fresh sample solvent and/or extra SDS and reducing agent in it (especially for concentrated sample solutions)作者也认为蛋白质在上样缓冲液中没有被全部打开是可能的。另外，火箭兄能否把这个“源”的两个单体的 N端C端之间的部分画个图，看看他们到底是怎样的相互作用。 还有，火箭兄说，这个蛋白质溶解性很差，是指表达成了包涵体，还是说结晶的时候极易沉淀而不能结晶？那么电泳的时候，使用的是包涵体还是溶液？包涵体的话，可能相互之间的作用不是NC末端的相互作用了，因为如果构象破坏，他们可能不能轻易聚头。
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gingivalis edited on
NC端相互作用图谱见附件，蓝色为一个单体的N端，红色为另一单体的C端，各标识了10个左右氨基酸，可以看到他们是平行排列，有很强的相互作用。蛋白表达后为可溶性形式，溶解性差是指活性蛋白在结晶过程中聚集沉淀了，没有得到结晶。现在感觉这种现象应该比较普遍，近期会改变样品处理条件后再进行SDS-PAGE分析，看是否有变化。图谱观看好像需要丁当，还有没有别的免费观看的方法？
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附件我帮你下下来改为RGB色彩的 jpg 格式，这样就能看了。说老实话，看不太清这个图，仔细分辨了一下，是不是黄色的 dash 代表氢键？ 貌似他们之间有四个氢键?.
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gingivalis edited on
好久不见火箭兄了，应skykiller兄邀请来学习这个帖子；“SDS-PAGE电泳时有一条分子量为目标蛋白两倍的条带，含量占主带1%-2%”，“还原前后仍存在，暗示该条带与二硫键无关”；质量肽图分析确认为相关蛋白，考虑二聚体。虽然还原后这条带仍存在，但我想知道，还原电泳和非还原电泳时这条带的含量有没有实质性的改变？ 我的理解是没有，因为后来火箭兄说了该蛋白单体之间无二硫键，仅仅通过疏水作用力聚合在一起。根据火箭兄的描述：1）3D结构预测显示单体的N端与C端之间有很强的相互作用力；2）尿素、盐酸胍等强变性剂都试过，“二聚体”仍然存在； 3）在水溶液放置过程中，“二聚体”含量有所增加。说明这个作用力很不容易打开，但很容易形成的，这是很矛盾的；酰胺键绝对不可能在这样的条件下形成。另外还有2个问题，1）变性后纯单体蛋白重新电泳，没有二聚体带形成，说明变性剂还原剂对这个作用力是有影响的；2）3聚体4聚体能打开，为什么2聚体打开不完全？不知道这个蛋白的具体信息，比如PI？有没有做过NATIVE电泳？等等我觉得1%-2%并不是个很大的量。以前实验室有做个四聚体蛋白WB的，确定是通过二硫键形成，但是不管加多少量的DTT，在二聚体和三聚体位置总是有条带曝出来。加上火箭兄所说“二聚体条带重新电泳后竟重新出现单体条带”，似乎又与前面的观点相反---这个力是容易被解聚的。所以我觉得可以把二聚体蛋白单独拿出来，再试试变性剂和还原剂，说不定有意想不到的发现。个人比较倾向多聚体未完全打开的观点。另外火箭兄关心的是什么力让这两个单体聚合在一起，不是二硫键，不可能是酰胺键，如果是是氢键或疏水键的话，应该能被变性剂打开，所以只能用打开不完全来解释，生化方面的再具体我就发表不上意见了。老朋友见面高兴，胡言几句，别拍砖，呵呵:D
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iris_palm edited on
不懂，学习一下！
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iris_palm 好久不见火箭兄了，应skykiller兄邀请来学习这个帖子；“SDS-PAGE电泳时有一条分子量为目标蛋白两倍的条带，含量占主带1%-2%”，“还原前后仍存在，暗示该条带与二硫键无关”；质量肽图分析确认为相关蛋白，考虑二聚体。虽然还原后这条带仍存在，但我想知道，还原电泳和非还原电泳时这条带的含量有没有实质性的改变？ 我的理解是没有，因为后来火箭兄说了该蛋白单体之间无二硫键，仅仅通过疏水作用力聚合在一起。根据火箭兄的描述：1）3D结构预测显示单体的N端与C端之间有很强的相互作用力；2）尿素、盐酸胍等强变性剂都试过，“二聚体”仍然存在； 3）在水溶液放置过程中，“二聚体”含量有所增加。说明这个作用力很不容易打开，但很容易形成的，这是很矛盾的；酰胺键绝对不可能在这样的条件下形成。另外还有2个问题，1）变性后纯单体蛋白重新电泳，没有二聚体带形成，说明变性剂还原剂对这个作用力是有影响的；2）3聚体4聚体能打开，为什么2聚体打开不完全？不知道这个蛋白的具体信息，比如PI？有没有做过NATIVE电泳？等等我觉得1%-2%并不是个很大的量。以前实验室有做个四聚体蛋白WB的，确定是通过二硫键形成，但是不管加多少量的DTT，在二聚体和三聚体位置总是有条带曝出来。加上火箭兄所说“二聚体条带重新电泳后竟重新出现单体条带”，似乎又与前面的观点相反---这个力是容易被解聚的。所以我觉得可以把二聚体蛋白单独拿出来，再试试变性剂和还原剂，说不定有意想不到的发现。个人比较倾向多聚体未完全打开的观点。另外火箭兄关心的是什么力让这两个单体聚合在一起，不是二硫键，不可能是酰胺键，如果是是氢键或疏水键的话，应该能被变性剂打开，所以只能用打开不完全来解释，生化方面的再具体我就发表不上意见了。老朋友见面高兴，胡言几句，别拍砖，呵呵:D嘿嘿，一个普通的帖子，引来这么多好友相助，内心非常感动，意外之喜。丁香园不仅让我们获取了知识，更让我们收获了珍贵的友谊！本蛋白还原前后二聚体条带含量无变化，应排除二硫键的影响。而且我们通过还原非还原质量肽图对比已经证明该蛋白单体和单体间均没有二硫键形成。这与某些二硫键导致的SDS-PAGE还原不完全出现多聚体是有差别的。这种蛋白天然多聚体蛋白很容易解聚，所以此处所指二聚体间作用力与正常单体间作用力不同，蛋白质溶解性很差，无法进行pI电泳和native电泳，也许毛细管能解决问题，但是没有实验过。目前我也在全力收集二聚体条带，如果能得到该条带纯品，通过质量肽图分析，与主带比对，一切疑问都会解决。
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学习了。最近本人也遇到类似的问题。用单抗做WB，目的条带很微弱，但在大约2倍分子量的位置有非常亮的条带，困惑中。。。
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应Skykiller兄之邀来学习！对于非二硫键二聚体真是不太专业，当年倒是做过一些二硫键的聚体。
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eastrocket 近期纯化一蛋白时发现一怪现象，SDS-PAGE电泳时有一条分子量为目标蛋白两倍的条带，含量占主带1%-2%。该条带经WB和质量肽图分析，确认为相关蛋白；还原前后仍存在，暗示该条带与二硫键无关，应为共价偶联形成的二聚体条带。您是说经过Mass Spec分析对吧？二聚体不一定非要共价结合的哦。除了二硫键外，其它相互作用如果很强的话SDS也打不开。比如吧，你查查LamB，在SDS PAGE中trimer，但3-D结构中没有共价键；我手头有一个蛋白， 在SDS-PAGE中是trimer。这个蛋白是个突变体，几个氨基酸突变后就形成稳定trimer，而Wild type蛋白在SDS-PAGE上是monomer，但做cross linking时可以看到trimereastrocket wrote:3D结构显示一单体的N端与另一单体的C端距离很近，有很强的相互作用，怀疑为N端NH2与C端COOH偶联所致；但该条带在水溶液放置过程中慢慢增多，理论上讲在水溶液中COOH很难和NH2形成酰胺键，只有在缩合剂DCC，DIMP等存在下才可催化此类反应，但储存溶液中无此类物质，难以解释；故怀疑为蛋白N端与C端超强非共价作用力（离子键、氢键、疏水作用力等共同作用）所致，但理论上讲SDS可以破坏此类作用力，即使不能破坏，该条带也应该恒定，而不应随着放置时间的延长而逐渐增多。感觉是time -d 你下面提到可溶性比较差，可能形成了比较强的疏水作用力。比如很多膜蛋白，一加热，就形成多聚体，即使SDS-PAGE上也能看到。或者时间长了，高浓度等等，都能形成非特异多聚体。不过一般会看到oligomer，仅仅dimer的少。eastrocket wrote:该条带含量极少，手头所有的纯化方法均不能有效将其与主带分离，只能通过制备型SDS-PAGE电泳的方法慢慢收集，切胶时已确保收集条带无单体蛋白干扰，但通过切胶收集的二聚体条带重新电泳后竟重新出现单体条带，其含量与多聚体条带含量各占50%。该条带颇诡异，请大家一同分析！如果是稳定的dimer，在gel filtration上应该可以分开；否则就是SDS变性使得形成部分多聚体。如果回收后的条带跑出monomer和dimer，请问上样量是否一致？如果您做一个梯度浓度的话会不会看到dimer随浓度增高而增高？有的Cys-disulfide 很强。有报道需要50 mM DTT才能打开的，但那一般是natural的而不是非特异的。如果怀疑N端相互作用可以考虑做个truncation。总之，我的看法是：蛋白放长时间了形成multimer是比较常见的。如果您认为这个值得研究或者这个dimer影响你的结晶或者别的实验呢，应该考虑把原因找出来，然后解决。否则要看您的时间和兴趣了。供您参考。
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火箭兄好久不见啊！不是很懂，学习一下！
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学习了，有些问题，你是用什么方法纯化的？什么类型的标签His or GST？这个蛋白中起主要作用的部分是哪一部分？如果单独表达起主要作用的部分有没有类似的现象？
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学习了，好贴。能否贴一个非变性和变性胶下你的蛋白跑电泳的图片出来。。有没有可能是其他蛋白修饰？，例如分子量变大的另一种常见形式为sumo化。建议一：用sumo抗体检测一下，看看是否在多出来那条带的位置检测出条带
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跟我这个帖子里第2楼遇见的问题“老同志遇到的第2个新问题：重组抗体IgG，变性电泳”，有点类似按道理，变性蛋白电泳时，SDS+还原剂，是能够把非共价键的结合给打开但事实上，我们在实际工作中，经常发现，有些结合，虽然不是共价键，但是也无法打开无论是加长煮沸时间，还是加大还原剂的比例
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从楼主的描述来看我们可以基本得出两点：1 这个蛋白确实可以形成二聚体，因为有wstern的结果 而且二聚体和单体存在着平衡关系。可能在不同的buffer中平衡常数不一样。2 3D分析提示N端NH2与C端COOH可以发生偶联，而且这种欧联不能被不能被SDS和DTT打断。偶联的具体的化学键目前很难断定。个人认为楼主如果想证明是不是N端NH2与C端COOH可以发生偶联而形成二聚体的话，可以在western上样的时候加入甘氨酸或者丙氨酸之类的氨基酸，利用这些氨基酸上的NH2和COOH来竞争单体之间NH2和COOH的偶联作用，也许可以减少二聚体的形成。 当然这只是间接证据。要真正证明的话就应该表达氨基端和羧基端缺失的突变单体，然后再用western验证二聚体是否存在，如果不存在了 那就可以说明他们的的作用确实是通过NH2与cooH的偶联而形成的。
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两个蛋白之间通过单个氨基和羧基的缩合，确实很难鉴定我看了一下楼主的描述，感觉不是共价缩合因为氨基和羧基的缩合，需要很大的能量，除非你的体系里有相应的生物酶存在，这种可能性是非常小的。我觉得楼主还是查阅更多的电泳信息吧，试试改变电泳的体系可以考虑换一些还原剂的类型和浓度梯度，样品做几个浓度浓度梯度，换换电压，电泳缓冲液种类多跑些胶，避免相邻孔的干扰我们遇到的IgG 100KD聚体条带，我们也认为是在样品处理或者是变性电泳的过程中，形成的（非变性电泳无100KD的带，只有IgG完整分子的带），用抗重链的一抗和抗IgG的一抗，分别WB鉴定过也识别（专门抗轻链的WB当时没做）
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tangdl2000 学习了，好贴。能否贴一个非变性和变性胶下你的蛋白跑电泳的图片出来。。有没有可能是其他蛋白修饰？，例如分子量变大的另一种常见形式为sumo化。建议一：用sumo抗体检测一下，看看是否在多出来那条带的位置检测出条带请教下，sumo化的话分子量一般会变化有多大？同样，如果是别的蛋白修饰，比如：磷酸化、泛素化等等，都有哪些已知的修饰方式以及每种方式大概的分子量变化是多大？火箭兄判断是二聚体，本身蛋白分子量多大？增加后条带又是多大？都是些问题哈，不太了解，很感兴趣，有谁小结过吗？
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受skykiller战友之遥参与讨论，只耐才疏学浅，可能提不出什么太好的意见和建议，仅根据自己的一点知识略说一二：1，分子量是目标蛋白的两倍，而且经过验证确实目的蛋白，这应该可以确定是二聚体，至于二聚体的形成力，二硫键或者N端与C端偶联的力只是我们常规知道的比较清楚一些的力量，生物体非常复杂，很有可能存在我们不知道的力量将他们联系在一起，所以是什么力量让他们联系在一起可能就是第一个问题2，如果这种力量是在这些样品中特异存在的，不排除有三聚体或者四聚体等的存在，只是有可能反应级数越高，存在的量越少，这是一个推测，是否可以通过改变胶的浓度（低浓度胶），采用WB的方式进行一下验证，3，至于该二聚体的不稳定以及和单体之间出现的平衡，而这种平衡又不受溶液中各种成分的影响的问题，首先可以推测，单体形成二聚体以及多聚体是一个反应过程，该反应过程存在一个平衡，由于前面第一点说推测的形成该反应的力量可能与二硫键和NC偶联无关，所以其平衡可能也不受溶液中的各种成分的影响。4，经过对单体和二聚体以及多聚体的深入研究，有可能会有重要的发现，附件的文献可以参考一下，也是主要关于单体和聚合体方面的研究，研究的方法很简单，但构思非常巧妙，得出了很有意思的推论。
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2dproteome 2，如果这种力量是在这些样品中特异存在的，不排除有三聚体或者四聚体等的存在，只是有可能反应级数越高，存在的量越少，这是一个推测，是否可以通过改变胶的浓度（低浓度胶），采用WB的方式进行一下验证，问了些跑题的问题，不过觉得也算相关讨论吧，呵呵还回到问题本身，看了楼上战友的发言以及这位战友的名字:D，突然想如果用LC/MS来检测会是什么样子？会有2个甚至多个峰出来吗？如果是，MS后是否可以判断是不是都是确定的几聚体了？还是问题哈。。。好像完全没有什么实质性建议。。。。只是感觉这个很有意思，学习讨论哈~~~
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丁香园准中级站友
好久不见这么有质量的讨论帖了，学习了！
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建议先跑一个 urea SDS PAGE 我也遇到过类似的例子
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1. 我的情况和你差不多，我的蛋白是由A-B两个不同分子量的亚基经二硫键连接组成的
2.在做还原性SDS-PAGE时，理论上应该出现A和B两条带，但是实际情况却出现了5条，经N段测序，ESI-MS-MS，等方法鉴定发现两条为A，两条为B,一条为B的C-短肽段，该样品在长温时间保存较长时会出现AA的二聚体，按照药典要求做SDS-PAGE根本无法用于此蛋白的纯度鉴定。
3.通过分析二硫键定位总计10条左右，糖基化位点有8个
4.我的蛋白经质谱MALDI-TOF测分子量鉴定蛋白较为均一，的确为AB两亚基分子量之和的单一质谱峰。经质谱肽图鉴定page上各亚基序列与理论也相符合。经三维结构鉴定，蛋白表面存在一个游离的半胱氨酸。还有一个Glc-NAc-Mannose的糖结构。
5.经HPLC鉴定蛋白纯度在98%以上。
6. 后来经对蛋白烷基化后进行N-page检测出现了单一的高纯的度条带。
7.对此蛋白的结构鉴定用了很大的人力物力和财力还有时间才完成。这是我一年多做的工作，希望和大家一起交流。
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我觉得二硫键即使经巯基乙醇处理或者DTT处理之后，二硫键虽然断裂，但是有些蛋白还会重新形成新的二硫键，如果是糖蛋白，在处理之后可以进行烷基化处理。有时会避免重新出现新的二聚体。
我觉得laboy战友的建议很好，试试改变电泳的体系。我做实验的时候同一种类型的电泳，不同的体系甚至是不同的人配置都会出现完全不同的结果，建议采用预制胶试一下，我的后来就采用预制胶，自己配的脚结果总是不那么漂亮。这个帖子有版主和很多资深战友的参与和讨论真是好，我是做重组蛋白生物制药的。顺便请教各位战友：
我现在做CHO细胞表达重组蛋白病毒去除的验证，以前生物制品只对血液制品要做这方面的验证，现在国家要求要做纯化工艺的病毒去除验证，现不知道该加入什么病毒进行验证，有没有做过这方面哺乳动物细胞表达重组蛋白的战友，大家是如何做验证的。
我参照国外ICH的资料，上面说的也很笼统，只是一个整体知道原则。现在还是一头雾水。
请版主帮帮忙，请各位战友帮帮忙，给些建议。
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haibei00 edited on
感谢大家的热心回复！上面有一些朋友提到了二硫键的问题。我可能是忘记告诉大家了，本蛋白体内有4个半胱氨酸，但是均未形成二硫键。该结果判断困扰了我一段时间，最后通过烷基化及肽图法才将其彻底搞清楚了。对于这部分实验，我的感触是：（1）如果蛋白中含有游离巯基，非还原情况下进行SDS-PAGE得到的结果可信度不高，SDS变性后游离巯基会错配，会形成二聚体和多聚体，同时单体间可能也会出现不同的配对形式，导致单体条带不均一，这个可能会影响大家对蛋白形式的判断。如果想排除此干扰，可以在不加还原剂的情况下，利用常用的烷基化实际对蛋白游离巯基进行封闭。（2）由于本蛋白无二硫键形成，则不存在SDS-PAGE时由于二硫键断裂不彻底而引起的二聚体形式，那么该二聚体只可能是其他共价连接或者极强的非共价连接。根据这段时间的实验，感觉应该是共价形式形成的二聚体，目前正在全力看展这部分实验，近期应该会有结果，有可能会发现一种较特殊的二聚体构成形式。待这部分工作全部完结后，我会将全部信息告诉大家。
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技术含量高的帖子，M之！
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期望知道结果，学习了
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学习了，精华帖啊！！同楼上，很希望能继续了解接下来的情况
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