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【求助】流式测ROS采用DHR123，求具体步骤 。谢谢各位师兄师姐。
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这个帖子发布于4年零258天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
本人初次接触流式，对流式的步骤一无所知，请各位大侠帮帮忙。最近刚买了sigma的DHR123,用于测细胞内ROS。现在不知道具体的孵育时间及浓度，查了些文章，有1μmol/L和5μmol/L的，孵育的时间有1h、4h、6h的。但是这些浓度和时间都不是我用的细胞，我的作用细胞是THP-1经PMA刺激后的巨噬细胞。不知哪位大侠知道？在此先谢谢了。另外，上流式前，是先用胰酶把细胞消化下来再孵育，还是先孵育后消化下来啊？先谢谢各位。
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使用流式细胞仪检测活细胞内的ROS基本原理：CM-H2DCFDA在细胞内水解成DCFH , DCFH被胞内的氧化剂氧化成高荧光强度的DCF ，用于检测ROS 的生成。Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)是非极性的化学物质能自由通透细胞膜。进入细胞后，被easterase去掉两个乙基, 形成具有极性的2’,7’- dichlorodihydrofluorescein(DCFH), 保留在细胞内。当细胞产生H2O2与DCFH反应,使DCFH形成了2’,7’ –dichlorodihydrofluorescein(DCF)，通过流式细胞仪测定细胞内DCF的荧光强度，即可对单个细胞为基础的细胞内ROS进行原位实时检测，从而根据荧光强度直接反映细胞内自由基的变化程度。（见下图）主要试剂：1.PC-12细胞株2.DCFH-DA粉剂（sigma）3.5 mg溶解于721 ul 100%乙醇中（这时的浓度为10.0 mM），之后用DMEM培养液稀释上述溶液10倍，配置成1.0 mM的储存液。-20°С避光保存。3.Aβ25-35（终浓度为30uM）4.AP（终浓度为10 uM）5其它如培养细胞常用试剂（DMEM高糖、胎牛血清、胰酶等），MTT操作方法：（1）
收集细胞：取对数生长期细胞收集细胞并调整细胞浓度至（1～10）×106/mL（2）
分别加入Aβ、Aβ+AP（六孔板），培养24小时（3）
装载探针：加入终浓度为10uM的DCFH-DA，37 °С 5 % CO2培养箱中静置0.5 h，每隔3-5min混匀一下，使探针和细胞充分作用。（4）
用无血清的培养基或温暖的PBS液洗涤细胞3次，去除未进入细胞内的DCFH-DA。（5）
收获各组细胞，上流失细胞仪检测ROS。激发光488nm，发射光 525nm（6）
实验分四组：PC-12(空白对照组)、PC-12+DCFH-DA(探针对照组)、PC-12+DCFH-DA+Aβ25-35（实验组）、PC-12+DCFH-DA+Aβ25-35+AP（给药组） 结果分析：
注意事项：（1）
处理过程绝对避光（紫外灯能不能开？）（2）
染料与细胞混合时间要充分（3）
探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高（4）
尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差（5）
细胞应保持良好的活性状态。贴壁细胞培养时不应超过瓶底面积的75%，悬浮细胞培养时其数目不能超过5×105/mL；贴壁细胞在消化处理时要尽量温和、快速，避免产生过多的细胞碎片（6）
使用流式细胞仪要确保侧面的细胞分散开（在与染料混合和处理时）（7）
流式细胞仪对细胞数目有一定的要求，一般为106，可以使用六孔板（8）
虽然一般要求将阴性对照组细胞调节电压至阴性置信区，但如果正常对照细胞DCFH染色较强、锋行太偏右，可适当降低电压，将锋行调节至中间，以便观察药物的抑制或促进作用（9）
测荧光最好不用塑料管
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sunrise84 请教：（1）你所说的处理过程是在探针装载完后用PBS洗涤，收集细胞到上机检测这中间的过程么？（5）贴壁细胞在清洗完探针后还要消化收集？（6、9）收集好的细胞用什么装比较好啊？
1.是的。最主要的时间段是探针加好后到吸出探针时，也就是使探针与细胞混合充分。在每隔3-5min晃动时最好能把灯全关掉。
2.探针装载好后，先吸出上清，后用PBS洗3遍（一定要洗的充分，否则最后背景很高，荧光强度很大），洗好后加入胰酶消化（感觉0.125%的浓度不错），自己摸索下时间，后加入含血清的培养基终止消化，收集所有细胞，离心1000转，5min，再吸出上清，加入1ml的PBS，离心，总共3次。
3.看你用什么方法测了，流式的话有专门的试管，共聚焦的话也有专门的设备，荧光酶标仪的话用96孔板就可以了。
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民间恺撒 我感觉你的整体数据还是可以的，就“损伤细胞+ DCFH-DA：68.84 ”这一组数据不对，应该是没弄好吧，你再试试。建议你下次就不用做空白细胞组了，其它每个组弄两个复孔，做下对比。我没有做阳性对照。不做也可以吧？我的GMean值分别为：1.空白细胞：2.942.空白细胞+ DCFH-DA：249.433.损伤细胞+ DCFH-DA：68.84 （直方图上出现了一小一大两个峰，小峰在左，大峰在右）4.损伤细胞+保护性药物（2.5uM）+ DCFH-DA：233.785.损伤细胞+保护性药物（5uM）+ DCFH-DA：202.276.损伤细胞+保护性药物（10uM）+ DCFH-DA：212.28损伤细胞+ DCFH-DA数值不好，暂不管；请问：1.请问数值相差多大算是有差异呢？2.比如第4组和第5组，数值相差31，这算有意义吗？3.我很纠结的是，第2组是荧光值是最高的，即使空白组和实验组可以差别不大，那也不应该荧光值高于实验组吧？您怎么看？ 谢谢，我的问题是不是太多了，麻烦您了啊！
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最好附上具体的流式步骤，谢谢各位。
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使用流式细胞仪检测活细胞内的ROS基本原理：CM-H2DCFDA在细胞内水解成DCFH , DCFH被胞内的氧化剂氧化成高荧光强度的DCF ，用于检测ROS 的生成。Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)是非极性的化学物质能自由通透细胞膜。进入细胞后，被easterase去掉两个乙基, 形成具有极性的2’,7’- dichlorodihydrofluorescein(DCFH), 保留在细胞内。当细胞产生H2O2与DCFH反应,使DCFH形成了2’,7’ –dichlorodihydrofluorescein(DCF)，通过流式细胞仪测定细胞内DCF的荧光强度，即可对单个细胞为基础的细胞内ROS进行原位实时检测，从而根据荧光强度直接反映细胞内自由基的变化程度。（见下图）主要试剂：1.PC-12细胞株2.DCFH-DA粉剂（sigma）3.5 mg溶解于721 ul 100%乙醇中（这时的浓度为10.0 mM），之后用DMEM培养液稀释上述溶液10倍，配置成1.0 mM的储存液。-20°С避光保存。3.Aβ25-35（终浓度为30uM）4.AP（终浓度为10 uM）5其它如培养细胞常用试剂（DMEM高糖、胎牛血清、胰酶等），MTT操作方法：（1）
收集细胞：取对数生长期细胞收集细胞并调整细胞浓度至（1～10）×106/mL（2）
分别加入Aβ、Aβ+AP（六孔板），培养24小时（3）
装载探针：加入终浓度为10uM的DCFH-DA，37 °С 5 % CO2培养箱中静置0.5 h，每隔3-5min混匀一下，使探针和细胞充分作用。（4）
用无血清的培养基或温暖的PBS液洗涤细胞3次，去除未进入细胞内的DCFH-DA。（5）
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注意事项：（1）
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染料与细胞混合时间要充分（3）
探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高（4）
尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差（5）
细胞应保持良好的活性状态。贴壁细胞培养时不应超过瓶底面积的75%，悬浮细胞培养时其数目不能超过5×105/mL；贴壁细胞在消化处理时要尽量温和、快速，避免产生过多的细胞碎片（6）
使用流式细胞仪要确保侧面的细胞分散开（在与染料混合和处理时）（7）
流式细胞仪对细胞数目有一定的要求，一般为106，可以使用六孔板（8）
虽然一般要求将阴性对照组细胞调节电压至阴性置信区，但如果正常对照细胞DCFH染色较强、锋行太偏右，可适当降低电压，将锋行调节至中间，以便观察药物的抑制或促进作用（9）
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这是我自己总结的，还没做，你可以参考下。有什么不对的望指出，谢谢。
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民间恺撒 这是我自己总结的，还没做，你可以参考下。有什么不对的望指出，谢谢。学习了，非常感谢。
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还有，不同的细胞用DHR123孵育的话，时间和浓度一样吗？
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时间是差不多的，但细胞浓度你自己可以摸下的，至少要106/mL吧，我觉得。
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民间恺撒 时间是差不多的，但细胞浓度你自己可以摸下的，至少要106/mL吧，我觉得。那浓度是最后上机测试前的细胞浓度吗？我那细胞种板之后就不长了，多少密度接种最后还是多少？还有，这个细胞浓度是流式一般的上机浓度吗？细胞密度太大或太小会不会影响结果啊？ 多谢。
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对啊，就是上机检测前要达到的，这样结果会好点。密度太小可能会检测不出吧。
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民间恺撒 对啊，就是上机检测前要达到的，这样结果会好点。密度太小可能会检测不出吧。多谢啊。
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民间恺撒 （1）
处理过程绝对避光（紫外灯能不能开？）（5）
细胞应保持良好的活性状态。贴壁细胞培养时不应超过瓶底面积的75%，悬浮细胞培养时其数目不能超过5×105/mL；贴壁细胞在消化处理时要尽量温和、快速，避免产生过多的细胞碎片（6）
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测荧光最好不用塑料管请教：（1）你所说的处理过程是在探针装载完后用PBS洗涤，收集细胞到上机检测这中间的过程么？（5）贴壁细胞在清洗完探针后还要消化收集？（6、9）收集好的细胞用什么装比较好啊？
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sunrise84 请教：（1）你所说的处理过程是在探针装载完后用PBS洗涤，收集细胞到上机检测这中间的过程么？（5）贴壁细胞在清洗完探针后还要消化收集？（6、9）收集好的细胞用什么装比较好啊？
1.是的。最主要的时间段是探针加好后到吸出探针时，也就是使探针与细胞混合充分。在每隔3-5min晃动时最好能把灯全关掉。
2.探针装载好后，先吸出上清，后用PBS洗3遍（一定要洗的充分，否则最后背景很高，荧光强度很大），洗好后加入胰酶消化（感觉0.125%的浓度不错），自己摸索下时间，后加入含血清的培养基终止消化，收集所有细胞，离心1000转，5min，再吸出上清，加入1ml的PBS，离心，总共3次。
3.看你用什么方法测了，流式的话有专门的试管，共聚焦的话也有专门的设备，荧光酶标仪的话用96孔板就可以了。
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民间恺撒 对啊，就是上机检测前要达到的，这样结果会好点。密度太小可能会检测不出吧。你好，我后来做了几次，但是数据都不稳，刚开始是细胞消化下来后孵育探针，前两次加完探针之后都没用PBS洗，荧光值一会高一会低，组与组之间也没差异。后来加完探针之后用PBS洗了一次，由于细胞少了好多就没再洗第二次，结果荧光值也低了，这种状况怎么解决？另外，我也试着先孵育探针后，用PBS洗3次，组与组之间有一点差距，但是不是理想的结果。我当时用的PBS是常温的，不是温的，这样会不会有影响啊？麻烦前辈给个建议啊，谢谢啦。
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请教 民间恺撒：我先消化后孵育，用PBS洗一次，虽然荧光值低了，但是组与组之间也没差异。我现在数据特别不稳，该怎么解决啊？另外，一定要加阳性对照组（H2O2）吗？谢谢。
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鲶鱼 你好，我后来做了几次，但是数据都不稳，刚开始是细胞消化下来后孵育探针，前两次加完探针之后都没用PBS洗，荧光值一会高一会低，组与组之间也没差异。后来加完探针之后用PBS洗了一次，由于细胞少了好多就没再洗第二次，结果荧光值也低了，这种状况怎么解决？另外，我也试着先孵育探针后，用PBS洗3次，组与组之间有一点差距，但是不是理想的结果。我当时用的PBS是常温的，不是温的，这样会不会有影响啊？麻烦前辈给个建议啊，谢谢啦。消化对细胞也是有一定的影响，建议你先加探针再消化，必须要多洗几次，我试过的，不洗的话背景很高（DCFH的本底很强的）。结果不理想，要从多方面考虑。方便的话将你的实验步骤写下来。H2O2阳性对照是为了检测探针是否失效了，最好加上吧。
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民间恺撒 消化对细胞也是有一定的影响，建议你先加探针再消化，必须要多洗几次，我试过的，不洗的话背景很高（DCFH的本底很强的）。结果不理想，要从多方面考虑。方便的话将你的实验步骤写下来。H2O2阳性对照是为了检测探针是否失效了，最好加上吧。我用的探针是DHR123（双氢罗丹明123）。我是将上清液取出放在流式管里，用PBS洗一次之后，将含探针的无血清培养基37℃孵育细胞1h，中间每10分钟摇晃一次。之后，弃含探针的培养基，用冷的PBS洗3次，胰酶消化，离心，PBS重悬后上机。那个H2O2阳性对照是怎么加的啊？是纯的H2O2吗？还是要稀释的？具体怎么加的啊？谢谢指教。
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胰酶消化之后，将之前的培养液倒回去，终止消化。而后收集细胞。
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我是在96孔板里面养的细胞，请问我可以直接在96孔板里加探针，然后上荧光酶标仪检测吗？
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鲶鱼 我用的探针是DHR123（双氢罗丹明123）。我是将上清液取出放在流式管里，用PBS洗一次之后，将含探针的无血清培养基37℃孵育细胞1h，中间每10分钟摇晃一次。之后，弃含探针的培养基，用冷的PBS洗3次，胰酶消化，离心，PBS重悬后上机。那个H2O2阳性对照是怎么加的啊？是纯的H2O2吗？还是要稀释的？具体怎么加的啊？谢谢指教。
我是将上清液取出放在流式管里？怎么理解。上清可以不用了啊，吸出用PBS洗一遍换成无血清的就可以加探针抚育了。
单独设一孔加H2O2，在加探针前30分钟左右加，之后一起加探针就可以了。一般买的话H2O2都是30%的，一般加到培养基里的终浓度大概在100UM左右，具体的配法可以参考下面的帖子。
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民间恺撒 edited on
我是将上清液取出放在流式管里？怎么理解。上清可以不用了啊，吸出用PBS洗一遍换成无血清的就可以加探针抚育了。
单独设一孔加H2O2，在加探针前30分钟左右加，之后一起加探针就可以了。一般买的话H2O2都是30%的，一般加到培养基里的终浓度大概在100UM左右，具体的配法可以参考下面的帖子。 好的，谢谢。我上清液是用来终止消化用的。我是孵育完探针之后将含探针的上清液弃掉了，用PBS洗的。然后用胰酶消化。那之后你是用什么终止消化的啊？谢谢。
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就用你的含血清的培养基终止就可以了。
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民间恺撒 就用你的含血清的培养基终止就可以了。好的，谢谢，我再试试。
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我是将上清液取出放在流式管里？怎么理解。上清可以不用了啊，吸出用PBS洗一遍换成无血清的就可以加探针抚育了。
单独设一孔加H2O2，在加探针前30分钟左右加，之后一起加探针就可以了。一般买的话H2O2都是30%的，一般加到培养基里的终浓度大概在100UM左右，具体的配法可以参考下面的帖子。 请问，单独加一孔H2O2的话，是指那孔不加药只有细胞和培养基，然后在加探针前30分钟左右，直接加在培养基里吗？那培养基不用换新的吗？谢谢。
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鲶鱼 请问，单独加一孔H2O2的话，是指那孔不加药只有细胞和培养基，然后在加探针前30分钟左右，直接加在培养基里吗？那培养基不用换新的吗？谢谢。恩，不用换的，直接加。30min后一起加探针。
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民间恺撒 恩，不用换的，直接加。30min后一起加探针。好的，非常感谢。
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民间恺撒 使用流式细胞仪检测活细胞内的ROS大神，你上面那两张照片是荧光显微镜下照的吗？流式仪应该看不到这种图吧？如果是荧光显微镜下拍的照的话，那用同一管样品，先拿到荧光显微镜下拍照，然后拍完接着去上流式，这样行吗？十分感谢！
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jomoo 大神，你上面那两张照片是荧光显微镜下照的吗？流式仪应该看不到这种图吧？如果是荧光显微镜下拍的照的话，那用同一管样品，先拿到荧光显微镜下拍照，然后拍完接着去上流式，这样行吗？十分感谢！恩，不是我拍的，这是书里面的，我直接拿过的。流式的应该是下面的图。可以的，不过要注意好时间。
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你用的DCFH-DA是哪个公司的？荧光显微镜下我照过，基本上是随着荧光激发时间延长，细胞内荧光越来越强。
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民间恺撒 使用流式细胞仪检测活细胞内的ROS请问您这个流式图是用什么软件处理的，看网上有winMDI，也有用FlowJo的，请问比较公认的是哪种，SCI文章一般都用什么处理啊？谢谢谢谢！
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jomoo 请问您这个流式图是用什么软件处理的，看网上有winMDI，也有用FlowJo的，请问比较公认的是哪种，SCI文章一般都用什么处理啊？谢谢谢谢！这个是我在书上看的，具体我也不清楚。一般都可以的，不过貌似FJ用的多点吧。
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民间恺撒 谢谢回答！请问是不是最后的结果就是看平均荧光强度，即GMean啊？我做的，GMean值分别为：空白细胞：2.94空白细胞+ DCFH-DA：249.43损伤细胞+ DCFH-DA：68.84 （直方图上出现了一小一大两个峰，小峰在左，大峰在右）损伤细胞+保护性药物（2.5uM）+ DCFH-DA：233.78损伤细胞+保护性药物（5uM）+ DCFH-DA：202.27损伤细胞+保护性药物（10uM）+ DCFH-DA：212.28难道是因为没洗干净？但是没被氧化的DCFH不是没有荧光的吗？能帮我分析下问题出在哪里吗？焦虑万分啊！！十分感谢！！！
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jomoo edited on
jomoo 谢谢回答！请问是不是最后的结果就是看平均荧光强度，即GMean啊？我做的，GMean值分别为：空白细胞：2.94空白细胞+ DCFH-DA：249.43损伤细胞+ DCFH-DA：68.84 （直方图上出现了一小一大两个峰，小峰在左，大峰在右）损伤细胞+保护性药物（2.5uM）+ DCFH-DA：233.78损伤细胞+保护性药物（5uM）+ DCFH-DA：202.27损伤细胞+保护性药物（10uM）+ DCFH-DA：212.28难道是因为没洗干净？但是没被氧化的DCFH不是没有荧光的吗？能帮我分析下问题出在哪里吗？焦虑万分啊！！十分感谢！！！结果就看GMean就可以了。你可以设M1和M2，其实做主要的是看M2的GMean().因为正常的细胞也会存在氧化反应，故DCFH加进去后也会有荧光的。我感觉你的整体数据还是可以的，就“损伤细胞+ DCFH-DA：68.84 ”这一组数据不对，应该是没弄好吧，你再试试。建议你下次就不用做空白细胞组了，其它每个组弄两个复孔，做下对比。原因可能：1.细胞数不一致，损伤药物加进去后细胞数已经很少了；2药物加入探针后没能很好的反应（光照，人为因素等）；3.我感觉最大的可能是不是在洗DCFH的过程中或胰酶消化的过程中把细胞都弄没了啊。
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民间恺撒 结果就看GMean就可以了。你可以设M1和M2，其实做主要的是看M2的GMean().因为正常的细胞也会存在氧化反应，故DCFH加进去后也会有荧光的。我感觉你的整体数据还是可以的，就“损伤细胞+ DCFH-DA：68.84 ”这一组数据不对，应该是没弄好吧，你再试试。建议你下次就不用做空白细胞组了，其它每个组弄两个复孔，做下对比。原因可能：1.细胞数不一致，损伤药物加进去后细胞数已经很少了；2药物加入探针后没能很好的反应（光照，人为因素等）；3.我感觉最大的可能是不是在洗DCFH的过程中或胰酶消化的过程中把细胞都弄没了啊。谢谢您的回答，我在另一个帖子里也问您是不是看Gmean值了，您不用回复那条啦，十分感谢！1.空白细胞+ DCFH-DA：249.43这组数值是最高的，按说正常细胞的氧化反应不至于和实验组这么接近，而且还高于实验组吧？2.横坐标（1
1000），我做的空白细胞组峰值在1---10之间，其他各组的峰基本坐落在100--1000区间内，请问在哪个区间范围内的才是活性氧的荧光呢？3.您觉得有可能是没洗干净探针，或者探针浓度过高的原因吗（我用的10uM）？4.另外，流式测的时候，不是可以每个组检测相同数目的细胞吗？那还存在您说的因为细胞数很少的原因吗？再次感谢！！
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jomoo 谢谢您的回答，我在另一个帖子里也问您是不是看Gmean值了，您不用回复那条啦，十分感谢！1.空白细胞+ DCFH-DA：249.43这组数值是最高的，按说正常细胞的氧化反应不至于和实验组这么接近，而且还高于实验组吧？2.横坐标（1
1000），我做的空白细胞组峰值在1---10之间，其他各组的峰基本坐落在100--1000区间内，请问在哪个区间范围内的才是活性氧的荧光呢？3.您觉得有可能是没洗干净探针，或者探针浓度过高的原因吗（我用的10uM）？4.另外，流式测的时候，不是可以每个组检测相同数目的细胞吗？那还存在您说的因为细胞数很少的原因吗？再次感谢！！1.有的就是差不了多少，H2O2损伤时差距会大点的，不知道你有没有做阳性对照?2.荧光主要是集中在100-1000区间里的。3.探针没干净应该是有可能的，但你都是一起弄的，一般不会的。4.我是说你在损伤细胞的时候，如果损伤太厉害了，细胞都死了，ROS都释放到细胞外。这时我感觉测培养基的ROS更有意义。
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十分感谢！！！！！
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关于丁香园酷派9150怎样开启数据保护（求具体步骤,最好有图，谢谢啊）？
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您好，酷派915的数据保护是酷派云安全的一个部分。云服务与安全功能向来是酷派智能手机当中的特色；不仅是商务机型的标配，主打时尚人群的炫影系列当中也是标配。如今Android的开放性所导致的安全威胁已经一天比一天严重，及时的采取措施才能避免掉不必要的损失。总的来说酷派的云安全服务通过“本地优化”和“通信以及网络的数据保护”两方面来实现对用户数据的安全保障；“本地优化”部分一来可以监控本地应用的权限，控制它们访问用户隐私信息的行为，起到类似防火墙的功能；同时又具备内存优化功能可以为系统提供足够的内存储备，来运行比较大的应用程序。“通信以及网络的数据保护”则涉及到一些通信卫士方面的功能，总的来说还是通过对于骚扰电话、恶意链接的阻断来维护用户的隐私。酷派9150的数据保护可以在其云安全里开启。如图：
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参考价：￥680.00
主屏尺寸4.5英寸
电池容量1700mAh
主屏分辨率960x540像素
后置摄像头800万像素
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