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药物基因组学和个体化医学转化的研究进展.pdf6页
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Acta Pharmaceutica Sinica
药物基因组学和个体化医学的转化研究进展
中南大学临床药理研究所,
湖南省遗传药理学重点实验室,
遗传药理学和药物基因组学作为新兴领域,
旨在促进个体化医学模式的早日实现。如何将遗传药理学
和药物基因组学的实验研究成果转化为实际应用是目前最为重要和亟待解决的问题。本文将综述国际上遗传药
理学和药物基因组学的研究成果在临床个体化治疗及新药开发领域的转化和应用的进展情况。
遗传药理学;
药物基因组学;
个体化医学
中图分类号: R968
文献标识码: A
Translational approach for pharmacogenomics and personalized medicine
ZHANG Wei, ZHOU Hong-hao
Institute of Clinical Pharmacology, Central South University, Hunan Key Laboratory of Genetic Pharmacology, Changsha
410078, China
Abstract :
Pharmacogenetics
pharmacogenomics
personalized
therapy. However, one of the most important issues to be conquered in the practice of personalized medicine is
the translation of scientific discoveries into better therapeutic outcomes. The international pharmacogenetic and
pharmacogenomic approaches made in the field of personalized medicine and drug discovery are summarized in
this review.
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最近做Red重组遇到问题，求教
最近做Red重组遇到问题，求教
我在含有pKD46的DH5α的大肠杆菌中要敲除一个基因，但是尝试十多次电转了，总是得不到阳性克隆。请各位帮我参详下~谢谢~~
1.线性打靶盒子的构建（经验证没有质粒模板造成的假阳性的干扰）
结构是【同源臂+FRT+氯霉素抗性+FRT+同源臂】，同源臂的长度为50bp，总长度为1300多bp，用Taq扩增（此时可能有A尾干扰）。第一次PCR产物用Dpn1处理，回收后作为模板进行二次PCR，将二次PCR产物跑胶，回收，浓缩，得到100ng/ul的打靶盒子
2.电转感受态的制备
用试管摇菌过夜，第二天以1%的接种量至含有Amp的LB培养基中，30℃培养，待OD=2.XXX后，加入0.2%的L-阿拉伯糖，30℃诱导35分钟（OD在0.4左右）。冰浴冷却。用超纯水洗一次，10%甘油（Sigma）洗两次，最终浓缩500-1000以10%甘油重悬（即150ml培养基大概用150-180ul的10%甘油重悬）。（注：没有像氯化钙法制备普通感受态那样每次重悬后都静置一会儿，是重悬起来马上离心的。还有，我是4000rpm，5分钟离心。虽然分子克隆上是2500rpm，20分钟，但是我用质粒电转试过，没差别的）
3.电击转化
将2mm电转杯从70%乙醇中取出，用灭菌超纯水洗2次，紫外灯照射30分钟。预冷。
取90ul（有时候50ul）最终重悬的细胞，移至预冷的离心管，加入5ul线性打靶盒子，用枪轻轻吸打混匀（因为混匀了感觉效率会高一点）（50ul也是加5ul的DNA）。冰浴30分钟。
电击后显示，电击时间为4.1ms到4.8ms。
4.复苏与涂布
加入1ml的LB，37℃，100rpm，1小时。然后每200ul涂布一个氯霉素平板（一共5个）。涂干。
30℃培养24个小时。（氯霉素抗性长得较慢，且没有卫星菌落）
我有以下疑问啊：
1.用平末端的聚合酶（如pfu、Primer Star）和带A尾的Taq扩增打靶盒子，进行敲除时有影响么？
2.同源臂50bp足够了啊，虽然有文献报道同源臂长一点也能敲除（《大肠杆菌O157：H7 EDL933w z3672基因缺失突变体的构建》）
3.L-阿拉伯糖的诱导浓度和时间各位是怎么安排的呢？我的L-阿拉伯糖是KAYON公司的（寿德送货）。
4.电转感受态制备的OD值各位怎么安排的？
5.离心时的转速与离心时间？
6.每次重悬后需要像制备普转那样静置么？最终收菌时的浓缩程度各位怎么安排的？
7.各位加入多少量的打靶盒子呢？加入DNA后会吸打混匀么？
8.电转参数如何？
9.有人说用SOC复苏比较好，真的么？各位复苏多长时间？复苏是在摇床里还是在培养箱里？
就是以上这些问题，如果有人给出好的建议，我会给你发Email分享我的MM图片，都是下面几张的层次。都是男人，君子好逑嘛。多谢拉~
怎么不能上传图片……只能用外链试试了……
如果不符合版规，请版主斧正。谢谢。
我也在做肠杆菌属的基因的敲除，看到楼主的帖子学习到很多东西，我想问一下楼主，你们制备电转感受态的甘油你特别标的是sigma的，这个对他的影响很大么？我在转pKD46的时候也老转不进去，不知道是不是甘油的问题啊，期待你的答复~~~ : Originally posted by hyacinth326 at
我也在做肠杆菌属的基因的敲除，看到楼主的帖子学习到很多东西，我想问一下楼主，你们制备电转感受态的甘油你特别标的是sigma的，这个对他的影响很大么？我在转pKD46的时候也老转不进去，不知道是不是甘油的问题啊 ... 影响挺大的，之前的某个牌子的甘油重悬后会使活细胞大量减少。至于pKD46老转不进去，这个普通的氯化钙法就很容易转的。我是一次性就转进去了。肯定不是甘油的问题。
恩，有问题再联系我。我南京农大的。 咳咳，见过拿金币诱惑别人回帖的，没见过那图片诱惑的啊:tiger36:
图片挺养眼哈，不过点到为止，区长不拍你我就不拍:tiger23: : Originally posted by 西瓜 at
咳咳，见过拿金币诱惑别人回帖的，没见过那图片诱惑的啊:tiger36:
图片挺养眼哈，不过点到为止，区长不拍你我就不拍:tiger23: 没办法，平时实验比较忙，有时间休息了还想看小说，所以没金币诱惑人啊…… 你可以在常温下试试，整个电转过程不用冰浴，包括电转杯。
详细的可以加QQ讨论， : Originally posted by chaovt714 at
你可以在常温下试试，整个电转过程不用冰浴，包括电转杯。
详细的可以加QQ讨论， 分子克隆上不是说如果不保持低温，电转的效率会降低几个数量级么？ : Originally posted by jel851223 at
分子克隆上不是说如果不保持低温，电转的效率会降低几个数量级么？ 我刚做了一轮电转化，挑出来的单菌落都是假阳性，重新探索中。
你的打靶片段加到感受态之后要冰浴30分钟这么久啊。
还有2mm的电转杯只加50ul感受态会不会稍微少了一 点，会不会不好加啊，杯子底部空间还是有的，我上次是100ul。
你的复苏时间会不会有点短，1h以上不。
还有我下想教你一个问题啊，同源臂的设计是不是也跟设计普通引物的方法一样的啊。跟目的基因的5‘端相同，3’端互补？我想确认下我的打靶片段的设计是否准确。 最后一步涂布后我们一般都放在37度培养，长得挺快的。我问过我们实验室的，之前也有不想pKD46丢失而放30度培养，但没重组成功。我们一般如果敲除后还在再敲，就再转一次pKD46进去。 : Originally posted by lincy2010 at
最后一步涂布后我们一般都放在37度培养，长得挺快的。我问过我们实验室的，之前也有不想pKD46丢失而放30度培养，但没重组成功。我们一般如果敲除后还在再敲，就再转一次pKD46进去。 这个有道理……给我邮箱吧，我兑现承诺。
另外，我其它的问题你看了么，就是1楼的。和你做的有没有什么不同？ : Originally posted by thestormcong at
我刚做了一轮电转化，挑出来的单菌落都是假阳性，重新探索中。
你的打靶片段加到感受态之后要冰浴30分钟这么久啊。
还有2mm的电转杯只加50ul感受态会不会稍微少了一 点，会不会不好加啊，杯子底部空间还是有的 ... 我们实验室都是50ul，反正转质粒是没问题的。。。。
冰浴时间长一点最起码没坏处吧……
复苏时间也试过2h，但是也没有……
同源臂和目的位置的序列是一样的，就是“它们”的3‘端一般会和FRT或lox位点相连。我这么说不知道你明不明白。 : Originally posted by jel851223 at
这个有道理……给我邮箱吧，我兑现承诺。
另外，我其它的问题你看了么，就是1楼的。和你做的有没有什么不同？ 挺多不同的
首先第一步片段浓度一般会更高，同实验室做大肠敲除的有的都达到1000ng/ul，反正高点没坏处，只要除杂够干净就好。
第二步中诱导加入量为1%或2% 1M的阿拉伯糖；如果菌不利用L-A，转接的时候加就行，也可以先培养3-4h，OD600达0.4再加，再培养一小时（35min可能短了点吧）；在完成培养后我们会多加一步，即菌液全部移到50ml离心管中，在冰中静置半小时；用10%甘油可多洗几次，转质粒一般洗两次，转片断做重组我们一般洗三四次。没有每次重悬静置，离心前我都会晃一晃。离心时间和转速是一样的，浓缩时50ml培养的菌最终三到四管100ul电转感受态。
第三步，电转大肠一般用100ul体系，不过50ul也试过，没问题。加入5ul片断后没有吹打，也不放在冰中(片断在加入前也是放冰上的)。最近做的电击时间都在5.4-5.8ms
第四步复苏时间为2h，转速140-160rpm
ps：图片就不用了 谢谢楼主了，我那个菌是阴沟肠杆菌，不是大肠杆菌，而且还产纤维素，所以没有尝试过普通化学转，不过这个可以试试~~~ : Originally posted by lincy2010 at
挺多不同的
首先第一步片段浓度一般会更高，同实验室做大肠敲除的有的都达到1000ng/ul，反正高点没坏处，只要除杂够干净就好。
第二步中诱导加入量为1%或2% 1M的阿拉伯糖；如果菌不利用L-A，转接的时候加就行， ... 还有一些问题：
1.你的打靶盒子线性片段是用taq酶扩增的吗？用pfu或PRIMER STAR很难获得高浓度DNA啊。另，你的除杂是用切胶回收还是乙醇回收？乙醇回收后不是会有引物二聚体么，会有影响吗？切胶回收又很难承载那么多DNA在电泳胶上。
2.L-ARA加入1%或2%是指终浓度么？我知道大肠杆菌DH10B是不能利用L-ARA的，那在这么高浓度的L-ARA生长4h会不会抑制细胞生长？
3.请问你50ml培养物最终收三到四管100ul电转感受态，菌体浓度够么（虽然总共摇了4h）？
4.你摇菌的50ml培养基、复苏的培养基都是LB吗？
5.复苏后你是不浓缩，直接涂布还是浓缩下（4000rpm，3min，吸去800ul，剩下200ul重悬菌体）后再涂布？
感觉你们实验室这方面的技术很成熟啊，可否加QQ或人人以便继续请教？我的QQ是（签名是一年上半次QQ。。。。），人人主页/jel851223。我南京农大研二，崔中利老师名下。
多谢之前的指点！ : Originally posted by hyacinth326 at
谢谢楼主了，我那个菌是阴沟肠杆菌，不是大肠杆菌，而且还产纤维素，所以没有尝试过普通化学转，不过这个可以试试~~~ 阴沟肠杆菌我不太熟啊，你看看文献里怎么做普转的吧，按理说阴性菌很容易转质粒的。不行就电转，都是肠杆菌属应该问题不大。
有问题再联系我。我的QQ：.另，上一楼的lincy2010 大神估计做得很好，你可以向他请教下洒~ : Originally posted by lincy2010 at
挺多不同的
首先第一步片段浓度一般会更高，同实验室做大肠敲除的有的都达到1000ng/ul，反正高点没坏处，只要除杂够干净就好。
第二步中诱导加入量为1%或2% 1M的阿拉伯糖；如果菌不利用L-A，转接的时候加就行， ... 另，你电转的参数如何？是2500V、200欧、25uF吗？刚才没想起来。 : Originally posted by jel851223 at
还有一些问题：
1.你的打靶盒子线性片段是用taq酶扩增的吗？用pfu或PRIMER STAR很难获得高浓度DNA啊。另，你的除杂是用切胶回收还是乙醇回收？乙醇回收后不是会有引物二聚体么，会有影响吗？切胶回收又很难承 ... 1、用全式金的高保真fastpfu酶扩增，因为我做的重点在重组而不是敲除，觉得taq酶保真性不够，我们实验室只在验证阶段用这个酶。高浓度的PCR的获得有个小窍门，我一般一下子p 10管50ul体系，有杂带就切胶回收，无杂带就直接回收，一般都用掉四管离心柱，EB洗脱时用50ul 70度水洗脱两次，四管总共得到400ul，然后再醇沉浓缩（步骤基本同提质粒的最后见步）。实验室也有人用过直接醇沉的，但杂质如离子、酶等经常除不干净，最终导致电转的时候电爆或电击时候过短，不过据说虽然短但他们也有长出转化子的，就是比较少。我用上述方法就重来没有电爆过，时间也都在5ms以上。至于引物二聚体是不影响电转过程的。
2、L-A配成1M的储存液，50ml LB中加500ul或1ml的储存液。不会抑制生长的，它只是糖类而已，至少我用过的几种大肠都没见有影响的。
3、够的，不过你也可以再浓点。长得快的菌我有时还只摇了2.5-3个小时呢，保证菌要在对数期
5、最终浓缩重悬于100ul再涂布。头几次做的时候还先吸100ul涂布一个板，剩余全部浓缩再涂一板，后来熟练后都直接全涂一板上了。
6、电转参数都一样
7、上一次回答表述有误，加完片段后的菌我们也是放冰上的，但不特地放置一段时间，可以直接用或放冰上等一会儿再转都没问题（我都试过）。整个过程所有步骤尽量在冰上操作（包括加入前的质粒，分装前分装用的EP管也预先放冰）
。呃~还有，你也可以试一下电转完后要加的LB事先加热到37度（可放在培养箱中，虽然有人说预冷好，有人说预热好，反正我做的时候预热一下效果都挺好的。当然常温也不会有太大影响） 呃，还有改一下13楼的，菌是总共培养3-4h，完成培养前一个小时加诱导剂，或者转接时直接加。刚刚重新看了一遍回复才发现打错了 分享一下我的方法
1、辅助质粒pKOBEG的转化
将提取的pKOBEG质粒DNA用电转的方法转入待缺失的受体菌，注意该质粒为温度敏感型，转化菌需在氯霉素平板上30℃培养。方法如下：
（1）& & & & 将-80℃冻存的菌种接种至LB平板，培养16~20小时，至平板上出现单菌落。
（2）& & & & 从平板上挑取单菌落至液体培养基，剧烈震荡培养3~8小时（依据细菌的生长快慢决定培养时间），至OD值约0.5~0.7。
（3）& & & & 将培养物置冰浴中10~20分钟（为获得最大效率的转化，在整个操作过程中细菌的温度不超过4℃是关键）。
（4）& & & & 取1.5~3.0 ml菌液，12000 rpm室温离心30秒（或2500 rpm, 4℃离心10分），收集菌体。
（5）& & & & 弃上清，加入1ml预冷的10%甘油，重新悬浮细菌，12000 rpm室温离心30秒（或2500 rpm, 4℃离心10分）。
（6）& & & & 重复步骤（5）2次。每次倾倒上清时要小心，因为10%甘油中的细菌沉淀附着力降低。
（7）& & & & 最后以50μl&&10%甘油重悬细菌，置冰上。
（8）& & & & 加入2~5μl pKOBEG。
（9）将含有pKOBEG的细菌悬液加入预冷的无菌电击杯中（选用的电击杯内径为0.2 cm），轻轻敲击电击杯，确保液体位于电击杯底部且无气泡，置冰上。
（10）打开电击仪电源，按SET VOLTS（电压）按扭，将电压调到2.50，其他的参数包括电容25μF，电阻200Ω。
（11）将电击杯插入电击槽中，用两手指按住电击按扭，直至听到“嘀嘀……”后松开手指。此时检查时间常数t（TIME CONST.按扭），时间常数应该在4.7~4.8 msec。
（12）加入1ml SOC培养基（也可用LB）至电击杯中。
（13）将电击杯中的液体转移至1.5ml Eppendorf管中，37℃缓慢震荡培养1小时。
（14）取100～200μl菌液，加入含氯霉素的LB平板，用无菌玻璃涂棒将细菌均匀涂布到整个平板表面。
（15）待平板干燥后，倒置放在30℃温箱中培养过夜。
（16）选择平板上生长良好的转化子进行菌落PCR鉴定（BEG-F/R），保菌备用。
2、同源片段的转化及重组
（1）挑取已转化有pKOBEG质粒的单菌落，在含氯霉素的双低培养基中30℃摇菌过夜；
（2）用50ml离心管1:100倍稀释菌液，即在24ml双低培养基中加入240μl菌液，再加入240μl 1M的阿拉伯糖（终浓度0.2%）和24μl氯霉素（双低培养基已经提前加入了氯霉素；同时多做一管用于动态测定OD值）。同时，做一份不加阿拉伯糖的平行对照。在30℃将菌摇至对数生长中期，即OD值为0.45-0.55（3小时左右）。
（3）将菌液转至42℃水浴，缓慢（30-40转/分）摇动15分钟，以使温度敏感质粒pKOBEG丢失。可通过涂普通LB平板检测细菌的Cm抗性来确定pKOBEG质粒是否丢失。
（4）在预先准备好的冰水中冰浴10分钟。
（5）4℃集菌（低温离心机5000rpm，10min），尽量把24ml菌全部集起。
（6）用冰浴过的WB（10%甘油）洗菌3遍（洗涤第一遍时将菌液转移至预冷的1.5ml离心管中），最后根据菌量加入适量的WB（也可不加入WB，EP管中残存的WB与沉淀直接混匀即可）。
（7）加入2~5μl卡那霉素抗性同源基因片段，电击条件为电压2.50kv、电容25μF、电阻200Ω，电击时间为4.7~4.8ms。
（8）加入500μl SOC培养基复苏1.5-2小时（50-80转/分），SOC培养基要事先放于室温（每管用完后废弃）。
（9）集菌，将所有菌液涂布卡那霉素抗性平板。对照因为没有加入阿拉伯糖无法刺激重组酶的表达而发生同源重组的效率较低，得不到缺失株。由于细菌新获得卡那抗性基因，生长较缓慢，所以需要37℃培养48小时。&& 查看话题
目的基因和表达载体总是连接不上，跪求大神帮忙。
各位大神好，我现在在做一种内切蛋白酶的基因克隆与表达。遇到的问题是该目的基因与表达载体总是连接不上。可以确定的是酶切、连接、转化操作都没有问题。但是筛选平板上总是一个菌落都不长。现在怀疑是不是因为表达载体上的P43启动子是组成型启动子，重组表达质粒转化进入感受态细胞DH5a后即启动了该内切蛋白酶基因的表达，从而对细胞产生毒性，将细胞杀死，导致平板上长不出菌落。在这一步已经卡了很久了，希望有类似经验的大神不吝赐教。
如果你担心细胞毒性的问题可以用pET系列的载体酶切酶连试一试~~构建重组质粒肯定没问题，之后用IPTG诱导表达~~
如果确实存在细胞毒性，其实也可以试一试用pHT系列的载体转化枯草芽孢杆菌后胞外分泌~~ 你能不能直接将目的片段连接在表达载体上吗？这样不是更直接可行吗？
还有就是你将克隆载体上的目的片段连到表达载体时，酶切点在克隆载体上是BamHI,XbaI两个，但在双酶切时你用的SmaI和BamHI，不一样啊，你切的点不一样，当然连不上去了 : Originally posted by lillian菲 at
你能不能直接将目的片段连接在表达载体上吗？这样不是更直接可行吗？
还有就是你将克隆载体上的目的片段连到表达载体时，酶切点在克隆载体上是BamHI,XbaI两个，但在双酶切时你用的SmaI和BamHI，不一样啊，你切的点 ... 那个是我写错了，双酶切肯定用的是BamHI,XbaI嘛。我也做过将目的片段直接连接表达载体，也是没有单菌落长出来。非常感谢你的回复。 : Originally posted by luwei13566 at
如果你担心细胞毒性的问题可以用pET系列的载体酶切酶连试一试~~构建重组质粒肯定没问题，之后用IPTG诱导表达~~
如果确实存在细胞毒性，其实也可以试一试用pHT系列的载体转化枯草芽孢杆菌后胞外分泌~~ 你说的很对。我前期是连接pET-22b（+）载体，非常容易就连接上了。IPTG诱导表达也很不错。但是现在连接这个表达载体就一直连接不上。 我倒是有个提醒，看看你的载体上BamHI,XbaI两个酶之间的距离，离得太近，会影响酶切效率的。
我以前也遇到过这种情况。 : Originally posted by lierhan at
你说的很对。我前期是连接pET-22b（+）载体，非常容易就连接上了。IPTG诱导表达也很不错。但是现在连接这个表达载体就一直连接不上。... 听你这么一说还真有可能是细胞毒性的事情，内切酶随着细胞生长就表达了，在对数期细胞快速生长需要表达多少代谢相关的酶啊，你的内切蛋白酶随便切几个关键代谢酶那细胞当然就不长了啊。
& & 如果是这样你就得尝试一下用枯草杆菌表达系统了，把酶直接分泌出去就没事了。
还有你这个载体是真核载体还是自己构建的载体？？看着好像酵母的表达载体~~但是酵母的载体好像又不是用的P43的启动子 : Originally posted by huahu3600 at
我倒是有个提醒，看看你的载体上BamHI,XbaI两个酶之间的距离，离得太近，会影响酶切效率的。
我以前也遇到过这种情况。 谢谢你的提醒，我用同样的方法将这个载体连过别的基因，非常顺利。唯独这个基因连接不上。我认为酶切位点距离太近酶切效率肯定是会受影响，但是不会导致完全切不动。 : Originally posted by luwei13566 at
听你这么一说还真有可能是细胞毒性的事情，内切酶随着细胞生长就表达了，在对数期细胞快速生长需要表达多少代谢相关的酶啊，你的内切蛋白酶随便切几个关键代谢酶那细胞当然就不长了啊。
& & 如果是这样你就得尝试 ... 我这个是自己构建的大肠-枯草杆菌穿梭载体。先在大肠杆菌中构建好重组表达质粒，然后导入枯草杆菌中进行分泌表达。可是现在重组表达质粒都构建不成功。构建重组质粒总不能在枯草芽孢杆菌中进行吧。连接液直接转化枯草芽孢杆菌感受态是不可行的吧？ 怪不得有两个ori，穿梭质粒这一块我不熟悉，不过枯草芽孢杆菌确实容易丢质粒~~圣诞快乐~！ 一个菌落没长不是后续工作问题，是你的载体有问题 建议测一下载体序列 : Originally posted by 262626 at
一个菌落没长不是后续工作问题，是你的载体有问题 载体的问题基本可以排除。因为我用同样的载体、同样的体系、同样的方法连接别的目的片段做过表达，非常顺利。非常感谢你的提醒。 : Originally posted by lierhan at
载体的问题基本可以排除。因为我用同样的载体、同样的体系、同样的方法连接别的目的片段做过表达，非常顺利。非常感谢你的提醒。... 缩短酶切时间16度1小时，试过没 : Originally posted by 262626 at
缩短酶切时间16度1小时，试过没
... 没试过。你的意思是说16度酶切一小时？为什么要这样做呢？ : Originally posted by lierhan at
那个是我写错了，双酶切肯定用的是BamHI,XbaI嘛。我也做过将目的片段直接连接表达载体，也是没有单菌落长出来。非常感谢你的回复。... 你好，如果酶切位点没错的话，那你可能是酶切后的产物浓度不够，还有就是酶切不成功，要不不会不长的。
你再检查下你用的载体的抗性有木有弄错，还有转化时平板加入抗生素的浓度也要注意，希望对你有帮助 : Originally posted by lillian菲 at
你好，如果酶切位点没错的话，那你可能是酶切后的产物浓度不够，还有就是酶切不成功，要不不会不长的。
你再检查下你用的载体的抗性有木有弄错，还有转化时平板加入抗生素的浓度也要注意，希望对你有帮助... 非常感谢。你说的当然有帮助，我再仔细检查下所有可能出现问题的地方。 : Originally posted by lierhan at
没试过。你的意思是说16度酶切一小时？为什么要这样做呢？... 什么都没错的话，会长没有被切开的质粒的菌，我觉得有可能是非特异酶切，把质粒都切碎了 现在我也遇到了这个问题，也怀疑毒性存。因为曾经做过一个蛋白的连接，所以现在只要连不上都认为这个问题 : Originally posted by weishengsu5 at
现在我也遇到了这个问题，也怀疑毒性存。因为曾经做过一个蛋白的连接，所以现在只要连不上都认为这个问题 你是怎么解决这个问题的呢？}