请教关于荧光共振能量转移（FRET）中的标记方法有哪些?请不要给我讲FRET技术.
小生wan148
每个研究问题都有特定的标记方法,目标当然是能够满足FRET的条件. 下面给出几个例子： 二、FRET技术的应用随着生命科学研究的不断深入,对各种生命现象发生的机制,特别是对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用的研究变得尤为重要.而要想在这些方面的研究取得重大突破,技术进步又是必不可少的.一些传统的研究方法不断发展,为蛋白质-蛋白质间相互作用的研究提供了极为有利的条件,但同时这些研究手段也存在不少缺陷：如酵母双杂交、磷酸化抗体、免疫荧光、放射性标记等方法应用的前提都是要破碎细胞或对细胞造成损伤,无法做到在活细胞生理条件下实时的对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用进行动态研究.FRET技术的应用结合基因工程等技术正好弥补了这一缺陷,下面是FRET技术在相关生命科学领域中的具体应用.1、检测酶活性变化（1）活细胞内检测蛋白激酶活性蛋白质磷酸化是细胞信号转导过程中的重要标志,研究其中的酶活性是研究信号通路的一个重要方面.以前酶活性测定主要是利用放射性以及免疫化学发光等方法,但前提都是要破碎细胞,用细胞提取物测定酶活性,还无法做到活细胞内定时、定量、定位的观测酶活性变化.而利用FRET方法就可以很好的解决这个问题：如zhang等人利用FRET原理设计了一种新的探针（一种融合蛋白）：新探针包含一个对已知蛋白激酶特异性的底物结构域,一个与磷酸化底物结构域相结合的磷酸化识别结构域.这个探针蛋白的两端是GFP的衍生物CFP与YFP,利用FRET原理工作.当底物结构域被磷酸化后,分子内部就会发生磷酸化识别结构域与其结合而引起的内部折叠,两个荧光蛋白相互靠近就会发生能量迁移.如果磷酸酶进行作用将其去磷酸化,分子就会发生可逆性的变化.该研究小组[3-4]用几组嵌合体来研究四种已知蛋白激酶的活性：PKA（protein kinase A）、Src、Abl 、 EGFR（epidermal growth factor receptor）.他们将构建的报导探针转入细胞,根据FRET来检测激酶活性变化.对细胞进行生长因子处理后,几种酪氨酸激酶都在几分钟内被激活,检测到25%-35%的活性变化.用forskolin激活PKA能增强FRET 25%-50%的变化,激酶在整个细胞质范围内被激活.如果将报导探针加上核定位信号使之定位于核中,则FRET变化被极大的延迟了,这也说明了PKA作用的区域性.由此可见,利用FRET方法可以很好的观察活细胞内酶活性变化,并且能做到定时、定量、定位,是一种非常有效的研究手段.（2）关于细胞凋亡的研究细胞凋亡过程大致可以分为三个不同的阶段：起始期—细胞通过不同途径接受多种与凋亡有关的信号；整合期—多种信号在此整合,细胞做出生存或死亡的决定；执行期—一旦做出死亡的决定,即将进入一个不可逆转的程序.天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate-specific protease,Caspase）在细胞凋亡的执行期发挥关键作用,近年来对其研究成为细胞凋亡领域的一个热点.而FRET技术的出现对此的研究提供了更为有利的条件：Reiko Onuki等人利用FRET技术研究了Caspase8与Bid蛋白之间的相互作用,Caspase8活化后作用Bid蛋白,使其裂解成两个片段,然后羧基片段转移到线粒体使其释放细胞色素C诱发细胞凋亡.研究者将Bid蛋白两端分别与CFP与YFP融合,精心设计使其在没有被裂解前刚好可以发生FRET,当Bid蛋白被裂解后FRET效应自然消失.所以是一种很好的检测Caspase8酶活性方法,而且当Bid蛋白与CFP与YFP融合之后仍能行使正常的功能,当融合物在细胞内被裂解后,连接CFP的片段转移到线粒体,通过CFP荧光可以很清楚的观测到其在细胞内的定位.另外Markus Rehm[6]与 Kiwamu Takemoto[7]等人利用FRET技术设计了可以反映Caspase3酶活性变化的融合报告蛋白,通过此报告蛋白证实了在细胞凋亡过程中Caspase3酶活性变化是一个非常迅速的过程.2、关于膜蛋白的研究（1）受体激活效应在细胞膜上的横向扩散膜蛋白的研究一直都是信号通路研究中的重点和难点.当细胞膜局部受外界刺激后,相应受体被激活然后向细胞内传导信号,可是在这之前是否会有细胞膜上的横向效应呢?近来Peter等人[8]在Science上报道：细胞膜局部受刺激后,膜受体活化效应可迅速扩展到整个细胞膜.他们将膜受体EGFR（epidermal growth factor receptor）与GFP融合,抗活化后的EGFR抗体用Cy3染料标记,刺激因子EGF（epidermal growth factor）用Cy5染料标记,这样可以很明显的看到EGF在细胞膜上的局部分布.当EGF作用细胞后,EGFR活化并与其抗体结合,于是GFP与Cy3染料充分接近发生FRET,利用此方法可以很明显的观测到细胞膜局部受刺激后,受体活化效应迅速扩散到整个细胞膜.（2）膜蛋白的定位修饰我们知道膜蛋白是定位在细胞膜上不同的亚区域中,例如脂质筏（lipid rafts）和小窝（caveolae）,小窝包含着丰富胆固醇、鞘磷脂和信号蛋白.那么这些蛋白怎样到达它们的目的地呢?Zacharias等在Science上报道,酰基化足以使这些蛋白定位在脂质筏.他们的研究是通过FRET（fluorescence resonance energy transfer）技术,用GFP的突变体CFP（cyan fluorescent protein）和YFP（yellow fluorescent protein）来进行.因为这些蛋白并没有细胞内定位序列,所以研究者将各种酰基化修饰的敏感序列加在这些蛋白上,研究它们在细胞膜上的分布.因为分布的微结构域非常小,所以当CFP和YFP共分布在同一个微结构域时,就可以用FRET来观测到.研究者最初是用激酶Lyn的酰基化序列加在这些荧光蛋白上,使myristoyl和palmitoyl侧链链接在CFP和YFP的氨基端.结果发现产生的FRET信号非常强,用能去除胆固醇而使小窝和脂质筏消失的MCD（5-methyl-β-cyclodextrin）处理也不能使荧光消失,所以这说明荧光蛋白已经非常牢固的结合在了一起.然后研究者用荷电的基团代替荧光蛋白上疏水的基团时,发现聚体形成被抑制了.3、细胞膜受体之间相互作用外界刺激因素向细胞内的信号传递一般认为通过其在胞膜上的受体,当配体与受体结合后,引起受体构象变化或化学修饰,介导信号传递.但是最近关于Fas及其同源物TNFR(均为胞膜上的三聚体受体)的研究发现：它们都可以在无配体存在的情况下自发组装,并介导信号传递,引发细胞凋亡.其中在鉴定Fas发生三聚体化的实验中使用了FRET技术：将Fas分别与CFP与YFP融合,利用此项技术可以很方便的观测到Fas单体是否发生聚合.Yogesh Patel等人研究两种递质多巴胺与抑生长素.发现SSTR5（the type 5 somatostatin receptor）与D2R（type 2 dopamine receptor）共同分布在大鼠脑中的一些神经元中,他们将两者共表达,发现加入多巴胺能的激活剂能增强SSTR5与somatostatin的亲和性,加入多巴胺拮抗剂能抑制SSTR5的信号传递,表达D2R能恢复SSTR5突变体与腺苷环化酶的偶联.这不由是人们想到：两种受体之间是否存在某种联系呢?终于,应用FRET技术（SSTR5用红色染料标记,D2R用绿色染料标记）发现了两者之间的直接相互作用.而且当两受体的配体都存在时才出现FRET,说明两受体被激活时才发生相互作用.4、细胞内分子之间相互作用 Rho家族的小G蛋白通过调节肌动蛋白的多聚化调控着重要的生理功能,象其他信号分子一样,这些GTPase的效应在时间和空间上都非常集中,那么如何检测它们活性的时空动力学呢? Klaus Hahn等在Science上报道了一种新的技术FLAIR（fluorescence activation indicator for Rho proteins）可很好的解决这个问题：他们将PAK1的能结合并激活Rac-GTP的domain PDB与荧光染料Alexa标记,微注射入表达GFP与Rac融合蛋白的细胞中.这样,当Rac与PDB相互作用时,GFP和Alexa就会足够接近以致发生FRET.这种方法能够实时的检测到在一个活的细胞中Rac的定位改变与Rac激活之间的关系.Matsuda 等人在Nature上报道关于细胞内Ras和Rap1激活,也是用了FRET技术：他们将Ras和Raf的Ras结合结构域（Raf RBD）与GFP的突变种YFP和CFP进行融合构建.他们将Ras和YFP融合,RafRBD与CFP融合,当两分子靠的足够近时,它们之间就会激发FRET,设计的蛋白Raichu-Ras,Raichu代表和Ras结合的嵌合单元.当把Raichu-Ras与特异性的GEFs（guanine-nucleotide exchange factors）和GAPs（GTPase-activating proteins）共表达,清楚的显示FRET的增加和减少与Ras突变体的激活和抑制有关.此外他们还用同样原理观测了Rap1激活.
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基于绿色荧光蛋白的新型FRET对探讨
随着生命科学研究的不断深入，对各种生命现象发生的机制，特别是对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用的研究变得尤为重要。基于绿色荧光蛋白的荧光共振能量转移技术(GFP-FRET)是探测活细胞中蛋白-蛋白相互作用的重要方法。一对合适的FRET供体/受体荧光对要求供体的荧光量子产率(QD)要尽可能大；供体和受体的光谱重叠积分J(λ)较大；供体和受体之间光谱干扰(cross-talk)要尽量小；用于FRET检测的荧光探针在特定的细胞中要有较高的信噪比(S/B)以及能量供体/受体对要有适度的光漂白性质。CFP、YFP为目前蛋白-蛋白相互作用研究中应用最广泛的FRET对。但CFP-YFP对存在有一定的不足(如荧光量子产率低、传能效率低、对环境敏感、CFP不适合用激光作为激发光等)。MiCy、Citrine、mKO为最近报道的三种新型荧光蛋白。MiCy的荧光量子产率高达0.9，而且由于它的最大激发波长位于472nm，更加适合使用激光(457nm)进行激发。Citrine是第三代的YFP突变体，其荧光量子产率也有了一定的提高，而且具有很好的抗酸性和抗光漂白性。mKO突变于从珊瑚中提取的一种新型荧光蛋白KO，其具有较高的荧光量子产率和稳定性，较好的抗酸性和抗光漂白性。从荧光光谱来看，MiCy的发射光谱与Citrine的激发光谱、Citrine的发射光谱与mKO的激发光谱都有了更大的重叠。基于以上考虑，本文就MiCy/Citrine；Citrine/mKO两对荧光蛋白组成新的FRET对的可行性进行讨论，并初步探索了三种荧光蛋白组成多色FRET组的可行性。
首先，构建了含有六个组氨酸标签的三种荧光蛋白MiCy、Citrine和mKO，而后在大肠杆菌中表达了MiCy、mKO和Citrine三种蛋白，并用金属鳌合亲和层析进一步纯化，纯化产物使用特异性酶(肠激酶)去除His-tag。
然后对三种荧光蛋白进行了光谱学研究。求得了MiCy/Citrine和Citrine/mKo传能对的Forster距离分别为5.81nm和5.65nm(而CFP/YFP传能对的Forster距离只有4.9nm)，从而说明了它们作为一对FRET对的可能性。并且进一步在荧光分光光度计和激光共聚焦显微镜上测量了二者作为FRET对的合理性。实验结果表明：无论在荧光分光光度计还是在激光共聚焦显微镜上，都能明显的观测到能量转移现象。
最后，初步探讨了MiCy、Citrine、mKO组成的三色FRET组的可行性，并且在荧光分光光度计上进行了验证，可以观察到明显的能量转移现象。
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万方数据电子出版社500 - 内部服务器错误。
500 - 内部服务器错误。
您查找的资源存在问题，因而无法显示。LANCE(R) TR-FRET 检测
LANCE(R) TR-FRET 检测
LANCE 生物化学 TR-FRET 检测灵敏、均相且便于使用，是 HTS 和 ultra HTS 的理想选择。
创新的历史
作为第一家将基于铕的 TR-FRET 商业化的公司，PerkinElmer 正积极地发展 TR-FRET 的性能和应用。在定义、合成以及优化铕螯合物和基于螯合物的生物学分析检测方面，我们已有30多年的经验。
更清晰的信号
通过使用供体和受体荧光团标记，TR-FRET 检测将时间分辨 (TR) 和荧光共振能量转移 (FRET) 原理的优势结合到了一起。当两个荧光团标记相互趋近时，能量将从供体转移到受体。因此，当相互极为靠近时（~ 9 nm 或更少），供体荧光的激发将导致受体荧光的发射。受体荧光的发光级别与供体受体络合物形成的程度成比例。
哪种 LANCE TR-FRET 检测适合您？您是否在尝试测量生物化学激酶的活性？您是否在研究 Gi 或 Gs 偶联 GPCR？要测量蛋白质间的相互作用或进行其他结合/酶的检测？要处理全长基质、细胞激酶或复杂样品？数种平台可供选择
PerkinElmer 提供两种 TR-FRET 平台：原始 LANCE（镧系元素螯合物激发）和新一代 LANCE Ultra。两者都使用铕 (Eu) 螯合物供体染料，但是有不同的受体荧光团：
ULight(TM) 受体染料 (LANCE Ultra)：小尺寸染料 (&800 Da)，是各种尺寸分子直接耦合/直接标记的理想选择（包括小分子和肽），可减少对标记分子的位阻，特别适用于使用直接标记基质的酶检测。
SureLight(R) APC 受体染料 (LANCE)：获取自捕光蛋白的较大染料 (&100,000 Da)，可充当大型触角，是距离跨度较大的间接检测的理想选择，特别适用于蛋白质间的相互作用。一系列应用已通过 LANCE TR-FRET 技术得到了研究，其中包括激酶检测、GPCR 活化、蛋白质间的结合、蛋白质与核酸的结合、蛋白质与小分子的结合、受体配体结合、核受体、受体二聚化、转译后修饰、生物标记物检测、蛋白酶等等。
Quick Links
Applications
From assay development to primary and secondary screening, LANCE Ultra technology provides researchers...&
LANCE Ultra TR-FRET 试剂已验证了 310 多种丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸激酶的性能和反应活性。这一高性能的生物化学检测方式可满足最为严苛的激酶筛选需求，并带来更高的生产率。作为一种时间分辨的荧光共振能量转移...&
可满足最苛刻表观遗传学应用要求的经过验证的一致解决方案。 -
久经验证且具有成本效益的 LANCE Ultra 试剂可用于确定肽修饰量，进而检测具体的甲基化和乙酰化状态。无需洗涤的均相 LANCE...&
LANCE TR-FRET 技术的多功能性使供体和受体染料对组件能够用于蛋白结合检测以及其他检测。可选择您需要的供体标记或受体标记试剂来设计您自己的检测。这是最灵活的试剂设计，拥有最常见的亲和性生物分子和铕螯合物标记试剂。LANCE...&
定制您的试剂无论您打算进行什么检测，实现目标均需要恰当的技术。我们可为肽、抗体、蛋白质基质或核苷酸定制标记，帮助您开发自己的检测方法。如果您需要，我们甚至可以为您进行检测开发。
定制蛋白质和肽的标记
这样您便可以开发自己专门的检定法，蛋白质、抗体或肽可使用以下技术进行标记：
LANCE(R)Ultra cAMP 和 LANCE(R) cAMP
检测：稳定且可立即用于 uHTS！
测量在 GPCR 激动剂和拮抗剂刺激下全细胞或膜受体产生的环 AMP。PerkinElmer ...&【福建省化学生物学重点实验室】研究方向-前沿Lab-分析测试百科网
福建省化学生物学重点实验室
实验室的研究方向：
生命有机磷化学
有机小分子合成与调控
天然活性物质与药物化学
生物信息学与药物设计
分子识别与疾病诊断
（一）生命有机磷化学
&&&&实验室主要学术带头人赵玉芬院士以生命有机磷为主线，在生命起源、五配位磷化学与生命化学、有机合成方法及机理研究等领域取得了诸多重要研究成果。尤其以五配位磷结构为依据切入了生命化学领域；发明了在水溶液中合成磷酰氨基酸的方法，发现这类化合物可以自身组装成肽，也可以与核苷形成核苷酸；提出了一种微型演化系统的假设，即在前生源条件下磷迁移的瀑布状模型。发现了丝组二肽作为最小的酶模型能够切断蛋白质和DNA。这方面的研究在国内外形成了较大的影响。
（二）有机小分子合成与调控
&&&&以有机小分子为探针，发展新技术、新方法，针对生命体系信号转导过程中的重要分子事件，开展化学生物学研究，揭示信号转导的调控规律，为重大疾病的诊断和防治提供新的标记物、新的药物作用靶点和新的先导结构，为创新药物的发现奠定基础。同时，促进化学和生命科学研究的衔接和交叉集成，形成新的学科生长点。
&&&&本方向的研究将分两个层次。首先，以生理活性小分子的合成化学为切入点开展合成生物学研究。发展高效、适应于组合化学和多样性导向合成的不对称合成方法学，进而通过所合成的活性天然产物及结构改造的拟天然产物（库），研究其对所涉及生物大分子的调控作用，即合成生物学与化学遗传学，用于揭示蛋白质的功能，最终用于药物研发。然后，利用化学小分子探针研究蛋白质的相互作用，以揭示蛋白质的功能。
&&&&酪氨酸酶抑制剂研究: 酪氨酸酶是生物色素合成的关键酶，它催化酪氨酸羟化形成多巴（单酚酶活力），并进一步将多巴氧化形成多巴醌，进而经过一系列的转变形成黑色素。因此，人体的皮肤色斑、果蔬的褐变、昆虫外表的防御紫外线辐射等都与酪氨酸酶活性有关。酪氨酸酶抑制剂的作用机理研究对阐明酶的作用机理、催化反应调控意义重大，抑制剂的应用前景广大，可以作为化妆品美白剂；果蔬保鲜剂预防褐变作用；生物杀虫剂；在医药上可以用作治疗多巴缺失的疾病如帕金森综合症、老年痴呆症等。
&&&&借助有机合成途径和现代分离与分析技术，合成高效低毒的抗肝癌和肺癌的多酚重金属新药。借助中药现代分离与分析技术筛选治疗神经疾病的单一皂甙化合物，选用蛋白质组学及相关分析技术筛选靶蛋白和研究治疗途径与机理，为研制高效治疗神经疾病提供新药物，其研究意义重大。
&&&&以海洋动物及微生物为研究材料,选用蛋白质组技术和双向分离系统等相关技术筛选、分离、鉴定各种具有生物功能的蛋白质。选用反向生物学和基因功能组技术，筛选、克隆及构建各种可用于治疗人类及养殖鱼虾类疾病的药物基因工程菌株。构建铁蛋白反应器用于连续监测内海流动水体的污染程度。以人类各种肿瘤组织和血浆为研究材料,选用蛋白质组学及相关的分析技术研究引起肿瘤形成的相关蛋白质与机理、肿瘤细胞凋亡机制、肿瘤细胞蛋白与抗肿瘤药物相互作用机制和寻找诊断肿瘤的新标志物等相关研究。以海洋软体动物中枢神经系统为研究材料,采用生物质谱和波谱等分析技术研究神经节中的功能蛋白和多肽的结构与功能,尤其在功能蛋白质的三维结构。建立筛选和研制医治人类各种神经疾病药物的比较模型和药物筛选模型。开展海洋硅藻浮游植物生态、赤潮、微藻生理生化及蛋白组研究。以微藻分子生物学和基因工程方向，包括有害赤潮藻的蛋白质组、生物钟基因功能，以及蓝藻基因工程等研究领域。
（三）天然活性物质与药物化学
&&&&从具有显著生理活性的天然产物出发，研究其合成、结构与生物活性之间的规律，以阐明药用生物有效成分，获得具有新结构的化合物或具有生物活性的单体；以天然活性化合物为先导化合物，通过合成、天然来源及生物转化等途径发展和获取活性小分子探针，探索其在信号转导过程研究中的生物学意义，以获得高效低毒的创新药为目的，发展具有我国自主知识产权的新药。
研究内容1：
&&&&从植物细胞培养系、植物共生菌、植物与共生菌的共培养系、植物共生菌与植物病原菌的共培养系等非传统生物培养体系活性追踪分离具有抗癌或抗真菌、抗细菌等生理活性的次生代谢产物；对结构类型新颖的活性化合物开展生物合成和作用机制研究。通过研究植物化学成分对共生微生物次生代谢途径调控的影响，探索次生代谢产物在植物-微生物相互作用过程中的生物学功能。研究结果可能对创新药物的发现以及探索植物-微生物之间的相互作用和协同进化机制有重要意义；从基因组学和纯培养两个方面对海洋共附生微生物的生物活性成分进行活性追踪分离，探索建立一种可充分、快速有效利用可培养海洋微生物资源的新研究模式，拓宽微生物化学的研究领域。为快速有效地发掘利用海洋微生物的代谢产物资源建立一种新的研究模式，并获得具有自主知识产权的活性先导物，为开发创新药物奠定基础。
&&&&建立了抗肿瘤活性抗生素茴香霉素（形式）、可克服多药耐药性的助抗癌剂Hapalosin、氮杂糖（糖苷酶抑制剂，如澳洲栗精胺；广泛地用于治疗糖尿病、病毒感染、肿瘤转移）、抗HIV药物等多种活性天然产物与药物的不对称全合成。申请多项药物及其中间体合成发明专利，并获授权。
&&&&参与承担完成了国家自然科学基金委化学科学部唯一&十五&重大项目&手性药物的化学与化学生物学&子课题。2008年申请的国家自然科学基金委重点项目出&重要生理活性天然产物的结构多样性全合成研究&已通过专家组会评。
研究内容2：
&&&&以深海极端环境DNA为资源，构建深海宏基因组文库，研究其克隆子次生代谢产物及不同DNA片段与其次生代谢产物的形成规律，筛选活性次生代谢产物，以期发现天然先导化合物，开发创新药物；以紫草素和姜黄素为代表的重要天然活性物质为探针，研究其分子结构片段在药物构效关系及其生物体内信号转导过程中的调控规律。从而为设计新药的目标化合物提供结构模式，经结构修饰、类似物的合成及系统的活性研究，总结结构与活性（毒性）的相关性，为药物设计和创新药物研发提供理论依据。
&&&&目前已完成深海宏基因组文库克隆子次生代谢产物LC-MASS质谱库的建立，用于活性次生代谢产物的筛选及生物合成规律研究；合成了系列具有萘醌和苯丙素等结构特色的化合物，完成了系列化合物的体内、体外代谢规律及诱导肿瘤细胞调亡的作用规律的研究。
研究内容 3：
&&&&酪氨酸酶抑制的应用基础研究：发现4-氯水杨酸是一个更具潜力的酪氨酸酶抑制剂，它对3种常见细菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）以及2种真菌（白色假丝酵母、黑曲霉）等微生物具有显著的抑制作用。通过研究，可望为发展一种既能防止果蔬褐变又能抑制果蔬腐烂的新型保鲜剂和设计新型的具有防腐功能的美白化妆品添加剂奠定理论基础。
&&&&在筛选酪氨酸酶抑制剂过程中，首次发现了头孢唑啉、头孢地嗪、头孢噻肟三种头孢菌素类抗生素对酪氨酸酶具有较好的抑制作用。在此研究基础上提出了这三种头孢菌素类抗生素可用以黄褐斑等皮肤色素性沉着性疾病的治疗，且在底浓度条件下其可应用于帕金森综合症等与L-多巴代射失调相关的疾病治疗。研究结果对于这三种抗生素的在医疗实践中的应用起一定的参考作用。
（四）生物信息学与药物设计
&&&&该方向旨在组织和集中一批具有不同学科背景的研究工作者，从不同的学科视角，利用信息学技术，开展生命科学、医学、药学和化学生物学等前沿交叉领域的创新型基础研究及应用开发工作；并为相关学科的系统化、规模化和理性化发展提供支持。具体研究内容包括生物信息学辅助药物设计及筛选，及其相关的功药物基因组学/蛋白组学、化学基因组学、药物代谢组学、药物毒理学等。
（五）分子识别与疾病诊断
&&&&以重要生命体系为研究对象，利用复合化学筛选方法和展示技术发现可特异性识别重要生命物质的识别配体；有机结合分子工程手段、纳米生物学方法和化学合成技术，构筑高分辨、高特异性合高灵敏分子探针；综合多种现代分析表征技术，建立实时、动态的单细胞、单分子分子成像和检测系平台。研究表征基因、蛋白等生物大分子结构及其相互作用，解析信号传导、代谢网络途径，定量描述和预测生物功能，为破译生命密码、新药研发、疾病预防和治疗提供理论与技术支撑。
&&&&发展高灵敏、高通量的生物分析技术和方法，生物活性物质表征新原理、新方法，化学物质与生物大分子相互作用和分子识别的分析技术，发展高通量的筛选技术，建立实时、动态的单细胞分子成像系统。开发这些生物分析技术在疾病诊断、检验检疫、环境检测及药物研发中的应用。
&&&&开展分子诊断学新技术和新方法研究，注重开发先进的具有自主知识的多个层次的平台型技术，用于重大危害疾病的诊断和现有技术难以实施的疾病诊断，包括基因诊断、免疫诊断等。
&&&&筛选高效诊断肝癌和肺癌多肽标志物，并应用于临床诊断。建立家庭普及型肿瘤诊断试剂盒和诊断简易分析技术，为实现家庭普及型诊断与监测肿瘤疾病提供新技术，减少死亡率和发病率。
&&&&选题的意义: 用于临床快速诊断,减少疾病诊断成本,提高分析效益,最终达到挽救更多生命的科学意义和价值。
研究内容1：
&&&&恶性肿瘤的临床诊断目前仍主要基于影像学检查组织和细胞的形态，其分辨率较低，难以实现癌症的早期诊断。特异性检测恶性肿瘤相关基因和功能标志物，是实现癌症早期诊断的一个最有效方法。然而目前发现的与恶性肿瘤相关的基因和功能标志物很少，且不足以阐明各种恶性肿瘤发生发展的分子机制，还无法广泛用于癌症的早期诊断。而基于抗体的蛋白芯片虽已被尝试用于来寻找与恶性肿瘤相关的蛋白质标志物，但由于恶性肿瘤的复杂性，以及抗体制备和应用上的局限性而效果甚微。因此寻找一种可直接获得癌变组织?癌变细胞的特征分子指纹，高效发现癌症发生、发展过程中的功能标志物，并实现这些功能标志物特异灵敏检测的方法，对于癌症的早期诊断和治疗具有非常重要的科学意义和临床价值。
&&&&我们以肿瘤细胞及其重要标记物为对象，采用发展高通量化学筛选方法，获得可特异性识别癌变细胞及其特征标记物的核酸适体分子。核酸适体（Aptamer，也译为核酸识体、适配子）是指从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲和性和高特异性地与靶标分子结合的单链寡核苷酸。核酸适体分子工程是上世纪九十年代初发展起来的新技术，它综合运用寡核苷酸分子的化学合成、生物靶标的设计、模拟自然进化的人工筛选、核酸的修饰与功能化等一系列分子工程技术，通过指数富集配体系统进化法（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），将不同序列组合的单链DNA或RNA在生物靶标上重复进行吸附分配、洗脱回收及聚合酶链扩增三个基本步骤实现生物靶标相关配体即核酸适体的筛选，再通过核酸化学进行制备、修饰及生物功能化，以达到对生物大分子、细胞等生物靶标的选择性检测、定位和其生物功能的调控。核酸适体的出现，突破了传统意义上关于核酸只是遗传信息存储和转运载体的认识，表明利用其结构的多样性可实现类似抗体的分子配体或分子探针的功能。核酸适体通过折叠形成特定的三维结构与生物靶标如蛋白质结合，它与靶标结合的特异性和亲合力与生物抗体相当甚至更强，能够区分靶分子结构上的微细差别，如一个甲基或羟基，D/L镜像体等。而且核酸适体与抗体相比具有许多优越性：如1）通过简单快速的化学合成产生，不依赖于动物或细胞，成本低，并且核酸分子序列所定义的组合库容量大，具备空前的多样性，体外筛选效率高,便于进行大规模、高通量的筛选和制备；2）适用范围广，可直接采用不具抗原性的小分子和生物体内不稳定或强毒性的靶标物；3）易于进行化学修饰，可根据需要定点修饰标记物和官能团，实现多功能化；4）分子量小（一般由20-40个核苷酸组成），组织穿透性好，有望直接运用于活体分子成像和药物传输；5）免疫原性小，无毒性，药物应用前景好；6）有极好的化学合成准确性、重复性和纯度，制备的批间误差小；7）合成速度快；稳定性好，不易失活，耐受变性，便于运输和长期储存。
&&&&我们以严重威胁我国人口健康的肺癌、肝癌等恶性肿瘤为研究对象，以癌变组织?癌变细胞为目标，以正常组织/正常细胞为对照，筛选针对癌变组织?癌变细胞的核酸适体，用筛选得到的核酸适体分离并获得相应的癌变组织?癌变细胞所特有的功能分子，获得癌变组织?癌变细胞的分子指纹，有效区分癌变组织?癌变细胞与正常组织/正常细胞在分子水平上差异，并以此发现癌症发生、发展过程中的新功能标志物及其表达、变化模式。在此基础上，利用核酸适体的分子识别特性和可大规模批量生产的优点，一方面将核酸适体与纳米技术、传感技术、芯片技术、分子成像技术等结合，发展恶性肿瘤功能标志物特异灵敏检测手段，建立癌症早期诊断的新方法；另一方面将以恶性肿瘤的新标志物为靶标，进行恶性肿瘤靶向治疗的基础研究。项目的设立将可望提高癌症相关标志物发现的效率，为恶性肿瘤的早期诊断开辟新途径，同时可为恶性肿瘤的发生发展机制的研究，靶向治疗和创新性药物的开发提供物质基础。
&&&&此外，我们拟通过噬菌体展示肽库悬浮相微珠淘选模型和噬菌体克隆流式微珠阵列鉴定方法的建立，创建一个国际领先的噬菌体展示肽库高通量筛选平台。该平台具有多种克隆同时检测、线性范围宽、重现性好、灵敏度高、反应充分、反应速度快、操作简便灵活、节省样品和试剂等优点，将推动噬菌体展示肽库技术在药物先导化合物发现及活性小分子探针获取中的应用。我们将以肿瘤坏死因子受体TNFR和具有中和活性的TNF-alpha单克隆抗体为靶分子，筛选具有高亲和力、高特异性的TNFR亲和短肽和TNF-alpha模拟肽，并运用先进的流式细胞分析方法，研究这些小分子短肽对于TNFR介导的细胞信号转导途径的调控作用。所建立的高效筛选体系可直接推广应用于噬菌体展示抗体、酵母展示文库等的高通量筛选，在活性探针的生物获取技术领域具有重要应用前景。
研究内容2：
&&&&随着功能蛋白质组学的发展，人们逐渐发现细胞中存在的一些低丰度蛋白质。如细胞因子、生长因子等在生命过程中起重要的调节作用。然而，传统的蛋白质检测技术无法对细胞、组织或体液中低浓度的蛋白质标志物予以准确测定，发展超高灵敏度、高特异性、通用型蛋白质分析技术对于信号转导途径的解析、蛋白质相互作用的研究、疾病的早期诊断等具有重要意义。运用激光诱导荧光和流体动力学聚焦技术，我们在国内首次研制成功单分子流式检测仪，实现了对单个藻红蛋白及单个DNA分子片段的检测，检测速率高达每秒上百次。以此为基础，我们将单分子流式检测仪升级为双色荧光检测，并借助抗原、抗体的高特异性识别，发展灵敏度高、特异性好的蛋白质分析技术。具体研究内容包括：
（1）发展超高灵敏的蛋白质免疫分析技术
&&&&以耦联有大量捕获抗体的聚苯乙烯微球为载体，将样本中的痕量靶蛋白富集在微球上，通过荧光报告抗体或核酸适体的标记（类似ELISA的三明治夹心法），使得微球上靶蛋白的荧光信号远胜于溶液中游离的荧光报告抗体或核酸核酸适体，可将溶液中蛋白质的检测灵敏度较传统方法提高2～3个数量级，实现fg/ml～pg/ml量级蛋白质的超高灵敏分析。通过与微珠免疫方法的有机结合，单分子流式检测技术不仅突破了其自身无法区分荧光报告抗体是否与靶蛋白结合的瓶颈，而且将靶蛋白的浓度定量由恒定流速下单位时间内的单分子计数转变为微球上报告抗体的荧光信号测定，更加易于实现和推广。此外，结合光学编码的微珠阵列技术，可实现样本中低丰度蛋白质的多指标同时检测。
（2）发展单细胞水平低拷贝蛋白的定量分析技术
&&&&传统的细胞信号转导研究手段是Western 免疫印迹（Western blot），一般需要5x106个细胞，获得的检测结果是整个细胞群的蛋白表达平均值，目标蛋白的检测灵敏度在ng级（～1010个蛋白分子）。结合荧光标记的单克隆抗体，流式细胞术已被广泛应用于单细胞层次的蛋白质快速定量分析，只需少量的细胞即可获得比Western blot高十倍的检测灵敏度，而且能提供单细胞水平蛋白表达量的统计分布图（histogram），精确度高，重现性好。Perez & Garry采用多色流式细胞分析，实现了复杂细胞体系中亚群细胞的丝裂素活化蛋白激酶家族成员（p38 MAPK，p44/42 MAPK，JNK/SAPK）、细胞存活通路成员（AKT/PKB），和T细胞激活通路成员（TYK2）活化情况的同时测定，实验结果表明信号转导途径的多元数据分析能够在单细胞水平对信号转导通路进行功能性鉴定。商品化流式细胞仪的检测限为几百个藻红蛋白，仍然无法满足低拷贝（如几十～几百）蛋白的单细胞检测需求。例如，当使用化合物或药物刺激培养细胞时，化合物或药物通过与细胞表面G 蛋白偶联受体、免疫受体、生长因子受体或细胞因子受体的结合引起细胞的活化，激活某些细胞信号转导途径，而源头的信号分子的表达量可能很低，唯有借助超高灵敏的检测手段才能捕获这些信息，完整地描绘细胞的信号转导途径。我们已研制出的具有单个藻红蛋白检测水平的超高灵敏流式分析仪将能满足生物学家在细胞信号转导研究领域对于低丰度信号蛋白的检测需求，包括同步检测细胞内两种低拷贝相关蛋白的磷酸化状态。此外，借助荧光分子数量已知的标准微球，超高灵敏的流式分析仪可实现单细胞层次低丰度蛋白表达量的准确计数，如活细胞表面受体表达拷贝数的准确测定。
（3）结合FRET技术，发展单细胞水平低丰度蛋白质相互作用的超高灵敏分析技术
&&&&随着绿色荧光蛋白GFP及其衍生的多色荧光蛋白被发现和创造以及融合蛋白表达技术的成熟，FRET技术已被广泛地应用于流式细胞仪，对活细胞内生物分子间的相互作用进行实时检测。具有单分子检测水平的流式分析仪能将FRET技术的应用对象拓展至单细胞层次低丰度蛋白质之间的相互作用研究。
研究内容3：功能蛋白质翻译后磷酰化荧光可视技术研究
&&&&蛋白质磷酰化是功能蛋白翻译后修饰的重要内容之一，其在生命过程中具有重要的作用。磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将ATP的磷酸基转移到蛋白的特定位点上的过程。 大部分细胞过程实际上是被可逆的蛋白磷酸化所调控的, 至少有30%的蛋白被磷酸化修饰。可逆的磷酸化过程几乎涉及所有的生理及病理过程, 如细胞信号转导、肿瘤发生、新陈代谢、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等。蛋白质磷酰化研究可提高人类对自身疾病机理的认识，为寻找靶向药物提供依据。
&&&&蛋白质磷酰化研究常用实验技术有X射线晶体分析法、核磁共振、质谱、32P-同位素标记ATP闪烁计数法、突变等。X射线晶体分析法、核磁共振、质谱等谱学技术为研究蛋白磷酰化激酶的结构功能研究提供了有力的工具。相对于蛋白激酶结构功能研究，蛋白质翻译后磷酰化分子机制与动力学研究却进展缓慢。究其原因在很大程度上可归结于在体、原位、适时表征技术的缺失。蛋白质翻译后磷酰化是一个快速、复杂的过程，宿主细胞的低蛋白表达、活性中间体/过渡态寿命短、多聚体蛋白激酶的调节亚基与催化亚基相互作用的复杂性等，给蛋白激酶催化磷转移机制与动力学研究设置了障碍。生物质谱在蛋白质磷酰化的作为位点研究领域发挥着重要的作用，但为克服非磷酰化肽对待测信号的抑制，需要复杂的前期分离与富集。质谱、32P-同位素标记ATP闪烁计数法、放射自显影测量或磷储屏检测、蛋白质印迹等技术在应用于磷酰化作用位点研究时，均是借助对磷酰化蛋白/肽的测定进行推断，蛋白质翻译后修饰研究的在体、原位、适时的可视化技术发展仍存在很大的发展空间。
&&&&荧光光谱作为一种对研究体系干扰小的光谱技术具有灵敏度高、线性范围宽、表征参量多等特点。荧光共振能量转移（FRET）、荧光相关光谱（FCS）、光漂白荧光恢复（FRAP）、荧光受命成像等技术已成为研究蛋白质作用的重要工具，尤其是荧光显微成像技术更是为研究组织、细胞、细胞器等生命体系中的化学反应及其动力学提供重要的手段。基于磷酰化位点双重免疫标记荧光能量转移的荧光寿命成像为研究磷酰化位点及动力学提供了可视化手段。但相对于蛋白研究的其他领域，荧光光谱技术在蛋白质磷酰化研究领域中应用还很有限。究其原因，主要是缺乏适用于蛋白质修饰后磷酰化研究的灵敏、特异的荧光探针。目前采用的荧光探针主要有识别ATP/ADP的小分子单标签荧光探针和基于抗磷酸化酪氨酸抗体复合体的荧光探针。蛋白翻译后磷酰化是一个复杂、快速、可逆的过程。对这一复杂、快速、可逆过程的动态跟踪给研究技术提出了多参量、相应快速且长时间稳定等技术要求。新型的功能化量子点荧光探针为应对这些要求提供了发展空间。
&&&&半导体荧光量子点由于兼具尺寸量子效应与构成材料特征，作为荧光探针，具有有机分子荧光探针所不具备的特性：1）吸收波长范围宽（基本上高于特定域值的光都可吸收），发射光谱窄，且非常具有尺寸依赖性，易于实现一元激发多元发射；2）生物相容性好，易于应用于分子、细胞、组织乃至整个动物个体等不同层次的生物样本；3）吸收系数大，量子产率高，光稳定性好，易于实现多种蛋白或细胞活性物质及其作用过程的长时间追踪；4）合成与功能化技术的进步，为构建特异、灵敏的荧光量子点提供了可能。半导体荧光量子点的优良性质，促进了其在分子生物学、蛋白组学、基因组学等研究中的应用。尤其是荧光量子点所具有的光稳定性，使得科学家能够通过活细胞成像实时观察受体、配体-受体相互作用过程。例如，科学家已成功观察到培育神经元中单个氨基乙酸受体的扩散动力学、神经传递素的吸收与信号传递、表皮生长素与工程细胞系蛋白质作用动力学过程等，这些过程的实时观察，使科学家获得了应用有机荧光探针分子标记所不能获得的信息，推进了人类对生命过程的理解。
&&&&利用核酸适体可分辨到微小基团差别的高选择性优点，通过体外筛选方法获得多对可以分别特异性识别修饰反应前后蛋白质的核酸适体。建立核酸适体蛋白修饰化表征传感新原理、新方法；利用探针分子设计技术将所获适体标记和优化成可识别并响应发光的核酸适体探针。发展基于核酸适体探针实时检测蛋白质修饰过程的新方法；建立基于核酸适体探针表征蛋白修饰动态过程的技术平台。发展基于纳米粒子、量子点、荧光放大高分子的信号放大方法，提高探针检测灵敏度。引入非天然碱基或对磷酸骨架进行化学修饰提高筛选的核酸适体在生物环境中的稳定性。探索实时在体检测蛋白修饰动态过程的荧光探针方法。以单一蛋白磷酸化为基础模型，开发可对多蛋白、不同修饰化过程的同时检测的核酸适体探针检测新技术。
研究内容4： 单活细胞基因成像研究
&&&&人类基因组测序工作的完成使生命基因科学的研究重点逐步从基因组数据的搜集、归档向基因数据分析、基因功能研究及其在疾病预测治疗和药物筛选的应用转移。在单个活细胞水平上研究信使核糖核酸的合成、加工、运输和在亚细胞结构分布是对基因功能研究的重要手段之一。如何在活细胞中获取信使核糖核酸的信息仍是生命科学领域的挑战性课题。传统的核酸分析方法如RNA的原位杂交技术一般要求对细胞或组织进行固定及预处理。RNA的原位杂交分析技术能有效地提供关于目标核糖核酸的分布与表达水平的数据，但是对样品前处理的要求使得该技术只能描述细胞生长某一瞬间的状态，而无法有效地提供RNA在细胞中的动态变化过程及对外界刺激的实时变化等重要信息。近年来，虽然基因芯片已成为研究基因表达的有力工具，该技术仍尚难以单细胞为研究对象，并且不能实时提供mRNA动态分布信息。当前，分子探针是进行活体成像的必要工具之一。这些探针必须符合以下两个条件：１）选择性识别目标分子，２）实时将分子识别信号转换成可检测物理信号。过去几年里出现了几种用于活细胞中标记RNA的探针技术和方法。这些技术方法包括绿色荧光蛋白融合RNA结合蛋白（GFP fused RNA binding proteins）,核酸染色染料SYTO-147, 二元线性荧光共振能量转移探针（Linear Binary FRET Probe）,猝灭自动连接探针（Quenched Auto-Ligation Probe）和分子信标（Molecular Beacons）。这些探针各有优点，但是无法满足单活细胞成像高灵敏与高选择性的检测的需要。该方向的目标是合成新型荧光材料和猝灭化合物以用于制备高信背比分子探针，以期对癌细胞中重要基因mRNA的分布和表达进行高分辨、高灵敏度研究，在细胞和分子水平上进一步加深对癌症的认识。这些探针和成像技术可用于探索不同抗癌药物对这些基因表达水平，及mRNA动态事件如合成、传输和分布的影响。对这些基因表达的动态分析和对外界刺激反应的表征将为肿瘤发病机理和肿瘤药效研究提供有效的分析工具。
研究内容5：
&&&&本方向着重从物理化学角度进行微流控芯片方法研究，在国内微流控芯片研究领域中具有鲜明特色。
&&&&微流控芯片即缩微实验室技术，可以大量节约试剂，进行快速高效的分析及合成，具有重大的科学研究意义和广阔的应用前景。由于芯片的微小尺度，呈现的物理化学现象较宏观世界有显著的差异，因而，研究微米尺度的特殊物理化学现象，对芯片单元操作技术的创新及化学与生物体系芯片研究具有重要意义。
&&&&建立多种材料的微流控芯片制作方法，提出聚焦电泳技术、低压电渗泵、新型电化学极谱技术等具有自主知识产权的单元操作技术，并与法国巴黎高等师范学院建立合作，利用这些技术进行单细胞的生命问题研究。
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