甘油浓度过高对细菌 甘油生长速度生长有何影响

大肠杆菌高密度发酵研究进展_百度文库
大肠杆菌高密度发酵研究进展
第22卷?第6期?????????中?国?预?防?兽?医?学?报????????Vol.22,?No.6??
?Nov.?2000
2000年11月??????ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine?
大肠杆菌高密度发酵研究进展
柴家前1,陆庆泉1,沈志强2,刘吉山2
(1.山东农业大学动物科技学院,泰安?.山东滨州畜牧兽医研究所,滨州?256618)
中图分类号?S852.612??????文献标识码?A??????文章编号?00)06_0471_03??大肠杆菌被广泛地用于基因工程菌的构建,以获得大量的外源基因产物,利用基因重组技术构建的基因工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺。生物工程菌发酵的目的是希望能获得大量的外源基因产物,尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表达不仅涉及宿主,载体和目的基因三者之间的相互关系,而且与其所处环境条件息息相关。因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远不够的,需要对影响外源基因表达的因素进行分析,探索出适于外源基因高效表达的发酵工艺。高密度、高产率和高浓度培养是近几年发酵工业的目标和方向[1]。近几年,人们对高密度发酵(highcelldensityfermentation)进行了大量的研究,并取得了可喜的成果。对于大肠杆菌,尤其是重组大肠杆菌的发酵来讲,实现高密度发酵,可相应地缩小生物反应器的体积和降低生物量的分离费用,从而降低生产成本,达到提高生产效率的目的。本文就大肠杆菌高密度发酵的影响因素,发酵工艺等进行了综述,并探讨了如何提高大肠杆菌高密度发酵工艺技术水平。1?高密度发酵的影响因素
利用一般的发酵工艺生产大肠杆菌或以其组建的基因工程菌的表达产物,大肠杆菌的生物量,表达产物在菌体内和发酵液中的浓度比较低,难以获得理想的生产效率和经济效益。应用高密度发酵不但可获得较高的生物量,而且可显著提高目的基因表达产物的浓度。高密度发酵对发酵设备有较高的要求,而且对发酵条件也有非常高的要求。影响高密度发酵的因素非常多,如细菌生长所需的营养物质、发酵过程中生长抑制物的积累、溶氧浓度、培养温度、发酵液的pH值、补料方式及发酵液流变学特性等。
1.1?营养源?高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达产物,需投入几倍于生物量的基质,以满足细菌迅速生长繁殖及大量表达基因产物的需要。高密度发酵对基质中营养源的种类和含量也比一般发酵方法的要求高。但基质中营养物质的浓度过高,超过一定的限度可使生长抑制物质大量积累,使大肠杆菌的生长繁殖和目的基因表达受到抑制,从而使生产效率下降。常规基质中营养物的比例对高密度发酵?:条件下大肠杆菌的生长是不适宜的。为了获得高密度发酵的理想结果,需要对基质中营养物质的配比进行优化,以满足细胞旺盛的新陈代谢对营养物质的大量需要。
大肠杆菌高密度、高表达发酵控制中优化碳源是关键因素。由于细菌利用葡萄糖生长速度快,并且测定方便,成为大肠杆菌发酵中最常用的碳源物质[2,3]。但基质中高浓度糖的存在会导致乙酸的形成,Riesenberg[4]曾报道当糖浓度超过50g?L-1后E.coli的生长受到抑制。因此保持基质中较低的碳源浓度是达到高密度和高表达的关键因素。陈坚,李寅[5]等就培养模式对大肠杆菌高密度培养生产谷胱甘肽的影响的研究表明,糖浓度为10g?L-1下发酵重组大肠杆菌WSH_KE124小时细胞干重达到最大(4.60g?L-1),各时刻细胞内GSH含量均高于其它糖浓度。李民,陈常庆[6]等对高密度培养大肠杆菌生产重组人骨形成蛋白_2A的研究也表明,基质中初糖浓度为10g?L
时细胞密度和产物表达量均获得了较
好的效果。由此来看,其质中初糖浓度为10g?L-1左右时,重组大肠杆菌的高密度发酵,基质葡萄糖的浓度可能要高于10g?L-1。以甘油代替葡萄糖作为细菌生长的碳源可减少代谢抑制物质 乙酸的积累,更易达到重组菌的高密度和外源蛋白的高表达[7,8]。杨汝燕等[9]对基因工程菌高密度发酵液中的碳源物质甘的定量检测及其浓度的优化控制进行了研究,结果表明,其质中的甘油浓度在5g?L-1对重组大肠杆菌进行发酵,最终密度达到120DO600,重组蛋白rhTNF?的表达量占菌体总蛋白的30%以上。
在营养源对大肠杆菌高密度发酵的影响的研究中,就碳源对发酵的影响作了大量的工作。但在高密度发酵中,基质内的其它营养物质,如氮源、微量元素,碳氮比,各种无机盐的含量等对细胞的生长繁殖和基因产物的表达也有很大的影响,因此需对之进行优化。徐皓,李民[10]等在对高密度发酵生产突变型重组人肿瘤坏死因子的研究中,就基质含磷量对发酵最终菌体密度和hrTNF?_DK2表达量的影响进行了探讨,结果表明,基质中磷酸盐的含量能影响重组大肠杆菌表达质粒复制的速率,因而是菌体生长和目的蛋白表达量的决定性因素之一。他们对其最适浓度进行探讨,通过试验表明,当磷酸根浓度过低时由于不能满足生长需要,菌体密度,
贡献者:xijunzhang
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[硕士论文]论文目录&摘要第1-6页 ABSTRACT第6-9页 第一章 前言第9-22页   · 生物柴油粗甘油的现状与发展趋势第9-10页     · 生物柴油副产物粗甘油的产生途径第9页     · 生物柴油副产物粗甘油的利用现状第9-10页     · 生物柴油副产物粗甘油的应用前景第10页   · EPA 和 DHA 概述第10-13页     · EPA 和 DHA 的结构及来源第10-11页     · EPA 和 DHA 的生理功能第11-13页   · 发酵法生产 EPA 和 DHA 的影响因素第13-17页     · 培养基组份第13-15页     · 培养条件第15-17页   · EPA 和 DHA 分析方法研究进展第17-19页   · EPA 和 DHA 的应用及需要注意的问题第19-20页     · EPA 和 DHA 的应用第19-20页     · 需注意的问题第20页   · 课题研究的意义第20-21页   · 主要研究内容第21-22页 第二章 材料与方法第22-31页   · 材料与仪器设备第22页     · 材料和试剂第22页     · 主要仪器设备第22页   · 实验方法第22-31页     · 粗甘油的制备第22-23页     · 畸雌腐霉发酵生产 EPA第23-24页     · EPA 分析方法第24-26页     · 裂殖壶菌发酵生产 DHA第26-27页     · DHA 分析方法第27-31页 第三章 结果与讨论第31-67页   · 发酵生产 EPA 相关结果与讨论第31-48页     · 菌体形态的比较第31页     · 发酵时间对菌体生长的影响第31-32页     · EPA 气相色谱定量分析结果第32-33页     · 初始粗甘油浓度对菌体生长及脂质积累的影响第33-34页     · 以葡萄糖和粗甘油为碳源的比较第34-36页     · 初始 pH 值对菌体生长及脂质积累的影响第36-37页     · 发酵温度对菌体生长及脂质积累的影响第37-39页     · 不同转速对菌体生长及脂质积累的影响第39-40页     · 装液量对菌体生长及脂质积累的影响第40-42页     · 培养条件各因素正交实验第42-45页     · 培养条件各因素响应面法优化实验第45-48页   · 发酵生产 DHA 相关结果与讨论第48-67页     · 种龄和接种量的影响第48-49页     · 种龄对细胞干重的的影响第49-50页     · 接种量对细胞干重的影响第50页     · 初始粗甘油浓度对菌体生长及脂质积累的影响第50-52页     · 以葡萄糖和粗甘油为碳源的比较第52-53页     · 初始 pH 值对菌体生长及脂质积累的影响第53-55页     · 发酵温度对菌体生长及脂质积累的影响第55-56页     · 不同转速对菌体生长及脂质积累的影响第56-58页     · 装液量对菌体生长及脂质积累的影响第58-59页     · 培养条件各因素正交实验第59-62页     · 培养条件各因素响应面法优化实验第62-67页 第四章 结论第67-69页 第五章 展望第69-70页 参考文献第70-74页 论文、参加科研情况说明第74-75页 致谢第75-77页
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甘油浓度对兔皮明胶膜性能与结构的影响
杨晖1,马良1,韩霜1,黄丹丹2,张宇昊1
1. 西南大学2. 重庆西南大学食品科学学院食品科学与工程
The effect of glycerol concentrations on the properties and structure of rabbit skin gelatin films
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乳制品消费对血清胆固醇浓度和代谢的影响
中国微生态学杂志 2001年10月第13卷第5期 ChineseJournalofMicroecology,October2001,Vol13No5
醇、三酰基甘油浓度几乎没有影响。胆固醇浓HDL-胆固醇、
度在5.0~8.0mmol/L的受试者,于6周内每天消费200ml用粪肠球菌(Enterococcumfaecium)和嗜热链球菌(S.thermophilus)作发酵菌制作的新鲜发酵制品(含E.faecium108~1012CFU/L和S.thermophilus10×1012CFU/L)或yogurt,研究要求随机、双盲、有安慰剂(有机酸酸化乳)作对照,发酵乳组于3周和6周时总胆固醇浓度分别降低3%和6%,且6周时LDL-胆固醇浓度下降10%,而安慰剂组未观察到以上变化,提出乳的降胆固醇作用依赖于发酵乳内细菌的存在[11]。
在人类受试者中进行有关发酵乳制品对血胆固醇浓度影响的研究已有初步结论。明确的结论受饮食脂肪含量变化、受试者起始低胆固醇浓度的影响,另外,研究制品的原料成分、细菌组成浓度也是不同研究结果间比较上的困难。3 细菌在肠道的定植
胃液pH是细菌进入肠的主要屏障,胃内通常仅含少量革兰阳性菌,如乳杆菌和链球菌。Charters等研究了乳杆菌和双歧杆菌在胃肠道环境中的生存能力,发现15个受试株在通过模拟胃环境时有14株丧失了生存能力,唯一的固有抗性株是发酵乳杆菌(L.fermentum)KLD;另外,添加乳蛋白可提高部分菌株对模拟胃环境的耐受力,使得L.casei212.3和婴儿双歧杆菌25962(Bifidobacteriuminfan-tis25962)成为模拟胃环境抗性株;添加粘蛋白并不改变乳
杆菌的耐受力。因此可得出结论,某些乳杆菌株和双歧杆菌种可活着通过人体胃,且这些细菌与乳制品或含乳蛋白食品一起摄入时存活更明显。
细菌在大肠内定植与其对肠上皮细胞的特异性粘附、对其他肠道菌的非特异性粘附、或在肠粘液层中渗透和聚结有
关。每天口服含1×10个/g双歧杆菌的发酵乳125g可增加结肠菌群中外源双歧杆菌的数量,且在发酵乳中兼有L.acidophilus(1×107CFU/g)时效果更明显[13,14]。因此,长期摄入含L.acidophilus和B.bifidum的发酵乳制品可改变肠菌群的组成、数量及其代谢。
4 肠细菌对短链脂肪酸(SCFA)和胆固醇代谢的影响
大肠内细菌发酵不被吸收的碳水化合物和内源性多糖以产生约100~450mmolSCFAs/d。已报道肠内产生乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的相对比例约为60∶20∶15,该数值主要与受发酵底物有关,人结肠内SCFAs的变化模式是发酵作用的证据[16]。
肠内存在的SCFAs被大肠吸收后经肝脏代谢,Wolever[17]
等验证结肠内SCFAs和血清SCFAs间的相互关系以明确结肠内产生的乙酸盐有多少转移入血,发现乙酸钠或丙酸钠的直肠灌注增加这些物质的血清浓度,乙酸盐增加总胆固醇并减少脂肪酸,而丙酸盐增加血糖(葡萄糖)并消弱由乙酸盐(胆固醇的一个前体物)引起血胆固醇过多的应答,该作用机制是丙酸盐抑制乙酸盐和血浆三酰基甘油以及血浆胆固醇结合。但细菌发酵作用产生丙酸盐的逐步吸收不会引起Wolever研究中乙酸盐与丙酸盐的相互作用,因为饮食直接摄入会引起丙酸盐的快速肠吸收[16]。要充分发挥发酵食品的降胆固醇作用,得产生足量丙酸盐以抵消作为脂合成前体物乙酸盐产生的影响。大肠内菌群组成变化或菌量增加会引起发酵作用增强和SCFA产生增多。由于血胆固醇与产生的各种脂肪酸比例有关而可通过该机制发生变化。5 肠细菌对胆酸和胆固醇代谢的影响
发酵乳制品中细菌降胆固醇作用的机制与胆酸代谢有关。胆汁酸和去氧胆汁酸、以及肝细胞内源自胆固醇的胆酸分别与氨基乙酸和牛磺酸结合,这些胆酸在小肠被吸收后直接进入肝脏。然而,在重吸收过程中,结合胆酸与肠微生物群酸的排泄比无菌鼠快。而且,保留在自然环境中的猪与无菌
环境中猪相比,前者具有较低的血清胆固醇浓度和4倍以上中性类固醇排泄量。Goddard等对鼠、豚鼠所作的研究也获得一致结果,在用2~10?Ci(74~370KBq)标记胆固醇注射入盲肠时,鼠和豚鼠在尿粪中分别有94%和90%的胆固醇是以类固醇排出的[18]。这些发现提供肠菌群不仅能氢化、脱氢、氧化胆酸,而且能断开支链以产生类固醇的证据。
已提出假如表现高度胆盐水解酶活性的某个乳杆菌株能在肠道定植,那么胆汁分解量就会增加,这最终导致胆固醇高转化率以产生更多胆酸[19]。嗜酸乳杆菌是具备该能力的乳杆菌之一,当其在一个含胆汁环境中厌氧生长时,能将实验基质中胆固醇去除并转化成胆酸[27]。在体内,胆固醇的去除是因为脱结合胆酸在大肠内不被重吸收而由粪排出,胆酸的排出导致其肠肝循环减少,从而增加胆汁合成。利用在含胆汁培养基上生长的不同嗜酸乳杆菌株的体外研究确已证明相应菌株有修饰胆固醇代谢的作用[20]。因为培养基中胆汁量并没有超过肠内正常浓度,可作出预测,体内也存在结合于胆汁酸的胆固醇,这种细菌性胆固醇的同化作用使得胆固醇不适宜吸收进入血液循环。6 结论
根据现有许多发现,当今市场上可获得一些发酵乳制品可能属于有用的胆固醇降低制剂,这些食品包括发酵蔬菜、含双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的yogurt和乳饮料、Kefir(含与酵母菌共生的几种细菌的一种发酵乳制品)等。消费食品中的高细菌数(>1×108CFU/g)将确保足够细菌数进入肠内以对代谢发挥影响,因为这些食品中含有的细菌是与改变胃内pH的其他大量营养物一起被吸收的,所以当细菌通过胃时细菌幸存数增多,一旦到大肠,这些细菌发酵不消化碳化合物并产生SCFAs,产生SCFAs的相对比例将可能改变胆固醇合成。还有,肠内细菌能将胆汁酸与胆固醇结合,引起粪内胆汁酸-胆固醇复合物的排出。通过肠肝循环致循环胆固醇
进入肝脏合成胆汁酸。因此,用适宜菌株发酵的乳制品可望引起循环胆固醇浓度降低,以减少人群中CVD的危险性。这些细菌必须是胆汁抗性株且具有脱结合胆汁酸和结合胆固醇的能力。如果符合这些标准,发醇乳制品可作为高胆固醇浓度降低以及CVD预防中的机能性食品。至今为止,含有活菌的制品[如yogurt、酸性乳(acidophilusmilk)、和kefir]所含有的菌株通常不能在人类胃肠道定居,结局是这些“外籍菌”不能定植在肠内而从粪便迅速清除。因此,益生菌制品的日常消费对代谢的长期影响是必不可少的。参考文献:
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题名: 耐高渗酵母发酵法生产甘油的工艺优化--渗透压调节及细胞膜透性调节及流加发酵的工艺优化
作者: 杨燕鸥
学位类别: 硕士
授予单位: 中国科学院研究生院
中文摘要: 耐高渗酵母发酵法生产甘油是甘油生产的一条重要途径。目前发酵法生产甘油存在着发酵液中甘油/残糖比低而导致甘油提取困难、甘油产率低、生产成本高等问题。为了最大限度的提高菌体产甘油能力及后期耗糖速率,本论文做了三方面的工作:首先,本文通过在发酵过程的不同时间添加不同量的NaCl,研究了耐高渗酵母在不同渗透压条件下的生长代谢特点及不同时间加入不同量的NaCl对发酵过程的影响,发现适时添加适量NaCl造成的持续高渗环境有助于菌体产甘油,提高甘油产率及转化率;其次,研究了两种多烯类抗生素,两性霉素和制霉菌素对耐高渗酵母的生长代谢和对发酵过程各参数的影响,证明通过加入多烯类抗生素增加膜对甘油的透性从而提高甘油的产量是可行的,并将渗透压调节和细胞膜透性调节结合起来,更大的提高了甘油浓度;最后,将流加发酵中的葡萄糖浓度和渗透压水平联系起来,研究了初始糖浓度、投入糖总量、最适维持糖浓度、氮源和磷源对发酵过程的影响,得出了在现有条件下的最佳流加方案。
语种: 中文
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杨燕鸥.耐高渗酵母发酵法生产甘油的工艺优化--渗透压调节及细胞膜透性调节及流加发酵的工艺优化.[硕士
学位论文].中国科学院研究生院.1999
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