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抗体常见问题
抗体常见问题
抗体溶解方法
方法1：我们的抗体（冻干粉）已经包含了0.01M PBS、1% BSA和0.1% 防腐剂（叠氮钠或庆大霉素），您只需要加入灭菌的双蒸水就行了。抗体溶解后，置于-20℃保存，最好分装后使用，避免反复冻融，可保证至少1年有效；
方法2：也可以只加入一半体积的双蒸水，再用一半体积的甘油补足，置于-20℃保存，这样抗体不会冻，有利于抗体的稳定。
后续试验时，再使用对应的缓冲液稀释成工作液，即用即配。
我们的抗体（冻干粉），在常温放置下，至少一个月有效；若在-20℃下保存（推荐），至少三年有效。
Antibodies are prepared with 0.01M PBS, pH 7.4 with 1% BSA and 0.1% Sodium Azide, prior to lyophilization. Currently, we offer both lyophilized and reconstituted antibodies, both resulting in final concentration of 1mg/mL. We recommend two ways to reconstitute antibodies in lyophilized form:
1) Reconstituting by directly adding 100uL of sterile, distilled water.
2) Alternatively, if glycerol does not affect the experiment, add 50uL sterile distilled water, followed by adding 50uL of glycerol.
抗体修复方式
修复液：0.01M 枸橼酸（pH6.0）或者0.05M EDTA（pH8.0）
抗体修复方法：
方法1：沸水浴修复，将盛有修复液和玻片的烧杯置于沸水浴环境，保持外部沸腾状态15min，自然冷却至室温；
方法2：微波修复，将盛有修复液和玻片的烧杯置于微波炉中，高火5min，停火3min，中火5min，自然冷却至室温。
免疫组化操作步骤
第一节 免疫组化操作步骤及抗原修复（供参考）
一、免疫组化操作步骤
（一）、仪器设备
1、 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉
2、 水浴锅
（二）、试 剂
1、 PBS缓冲液（pH7.2―7.4）
2、 0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,pH6.0,1000ml）
3、 3%甲醇―H2O2溶液：用30% H2O2 和80%甲醇溶液配制
4、 风裱剂：
a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合
b. 油和TBS（PBS）配制
5、 TBS/PBS pH9.0–9.5，适用于荧光纤维镜标本；pH7.0-7.4适合光学纤维标本
（三）、操作流程
1、 脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟
a. 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后在浸泡10分钟
b. 无水乙醇中浸泡五分钟
c. 95%乙醇中浸泡五分钟
d. 75%乙醇中浸泡五分钟
2、 抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片
二、抗原修复（免疫组化石蜡切片）
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片需要抗原修复。
福尔马林固定的组织有可能破坏了原来组织的抗原结构，蛋白多肽发生交联，导致部分抗原表位封闭，结合位点减少，所以需要抗原修复，以暴露原来的抗原表位，达到充分显露抗原，以不出现明显脱片现象为佳。
抗原修复的几种常用方法（供参考）
1、 微波炉加热：
在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。根据玻片情况可参考采用微波加热“3-5-3法”3分钟温火沸腾后静止5分钟，再温火沸腾3分钟即可。
适用的抗原：来源于人、大鼠、小鼠的组织标本；来源于其他动物种属的组织标本。
2、 沸热修复：
电炉或水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
3、 高压热修复：
在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（骨及软骨组织的标本最好选择较温和的微波加热修复） 。
4、 酶消化方法：
常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。
适用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等。
三、石蜡切片免疫组化染色步骤
1、三步法（以SP试剂盒为例）
- 石蜡切片脱蜡至水
- 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如果采用抗原修复，可在此步后进行
- 3% H2O2 室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次
- 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜
- PBS冲洗，2分钟×3次
- 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟
- PBS冲洗，2分钟×3次
- 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟
- PBS冲洗，2分钟×3次
- 显色剂显色（DAB或AEC）
- 自来水充分冲洗，复染，脱水透明、封片
- 如果必要，可选用avdin封闭内源性生物素
- 脱蜡、水化
- PBS洗2次各5分钟
- 用蒸馏水或PBS配制新鲜的3% H2O2 ，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次
- 抗原修复
- PBS洗5分钟
- 滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体
- 滴加Ι抗50ul,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时
- PBS洗3次各2分钟
- 滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分钟
- PBS洗3次各2分钟
- 滴加试剂SABC 20℃-30℃ 20分钟
- PBS洗4次各5分钟
- DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色
- 脱水、透明、封片、镜检
四、冰冻切片的免疫组化染色步骤
- 速冻组织
- 冰冻切片4~8μm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱
- 室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，也可根据需要选择其他的固定方式
- PBS冲洗，5分钟×3次
- 用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性
- PBS冲洗，5分钟×3次
- 下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）
第二节 免疫组化抗原热修复的技术要点（供参考）
一、抗原热修复温度和时间的关系
我们日常工作中所使用的组织固定液福尔马林会引起组织蛋白内或蛋白之间的亚甲基发生桥连，具体过程如下：
第一步：基本反应福尔马林和氢反应形成新的化合物；
第二步：基本反应福尔马林和氢反应形成新的亚甲基桥。
上述反应的结果导致许多抗原决定簇被封闭，而加热可以水解该桥连使抗原被激活。影响抗原热修复的两个最关键的因素是温度和时间，有人将这两种因素对抗原修复的影响总结为下面的公式： 抗原热修复的有效性=加热温度（T） × 加热时间（t）。
也就是说当我们修复时的温度越低则需要修复的时间就越长；反过来当修复温度增高时修复的时间可以适当地缩短，才能使抗原决定簇完全暴露
如果修复强度不够，免疫组织化学染色所显示的只能是修复后暴露的部分抗原决定簇，而不是组织所含的全部抗原。这样的染色结果可能会非常弱，或出现假阴性，即使是阳性结果，充其量只能起到定性的作用，不能适应今后对免疫组化进行定量的需要。这就给我们诊断中定量指标的应用带来困难，例如用来测定耐药的指标。
二、组织固定时间和所需的抗原热修复的关系
大量的实验表明，固定时间越长的标本，它所形成的桥连就越紧密，抗原就越难以被激活，所需要的修复强度也就越强。有意思的是随着固定时间的延长，组织中蛋白对温度的耐受也相应增高，这可能就是我们对固定时间长的标本加大修复强度的理论基础。
这就提醒我们在做回顾性的研究时一定要注意所使用的修复条件，它与新鲜标本的修复条件一定是有所区别的，同等条件下一定要加长修复的时间或提高修复所使用的温度，才可能得到比较满意的结果。
三、不同pH值抗原修复液对染色结果的影响
抗原热修复中所使用的修复液pH值也会对染色结果产生相当大的影响。
pH值对染色结果的影响大概可以分为以下四种情况：
A.稳定型，pH值对染色结果影响不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等；
B.V型，高pH值和低pH值染色较好，而pH值4-5染色结果较差，如ER、Ki-67等；
C.上升型，随着pH值的增加，染色结果逐渐增强，如HMB45等；
D.下降型，随着pH值的增加染色结果逐渐减弱，当然这种类型的抗体只是个别的现象，如MOC31。
一个有趣的现象值得注意，即在高pH值都有较好的染色结果，所以目前比较推崇的抗原修复液为高pH值得修复液，如1mMEDTA, pH8.0或pH9.0等。但是由于传统习惯，绝大多数医院和实验室都在使用pH6.0的枸橼酸缓冲液。综合以上各种抗体的染色状况，考虑到临床工作的实际情况，许多国外免疫组化专家建议，在常规的免疫组化工作中，全部选用高pH值得修复液来代替目前广为使用的pH6.0枸橼酸缓冲液。为此，本公司已经推出pH8.0和pH9.0的新型抗原修复液。经验证，绝大多数的抗体使用pH9.0得修复液效果都要优于pH6.0的枸橼酸，尤其是核阳性的抗体。所以，在常规的免疫组化工作中，使用高pH值的抗原修复液是今后的必然趋势。
免疫组化问题解答
1、染色过强？
1.抗体浓度过高或孵育时间过长
2.孵育温度过高超过37度
3.DAB显色时间过长或浓度过高
1.降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过夜
2.一般在室温20-28度
3.显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准
2、非特异性背景染色？
1.操作过程中冲洗不充分
2.组织中含过氧化物酶未阻断
3.组织中含内原性生物素
4.血清蛋白封闭不充分
1.每步冲洗3次每次5分钟
2.可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长
3.正常非免疫动物血清再封闭
4.血清蛋白封闭不充分
3、染色弱？
1.抗体浓度过低、孵育时间过短
2.试剂超过有效使用时间
3.操作中添加试剂时缓冲液未沥干
4.室温太低，低于15度
5.蛋白封闭过度
1.提高抗体浓度、孵育时间不能少于60分钟
2.应更换试剂
3.每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释 （应防止切片干燥）
4.要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4度冰箱过夜
5.封闭不要超过12分钟
4、染色阴性？
1.操作步骤错误
2.组织中无抗原
3.一抗与二抗种属连接错误
1.应重试，设阳性对照
2.设阳性对照以验证试验结果
3.仔细确定一抗二抗种属无误
Western Blotting 操作步骤
一、Western Blotting 实验步骤概述
1、 组织取材：组织块称重
2、 利用液氮、研钵粉碎组织块
3、 加入RIPA缓冲液（每克组织3ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），
利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃
4、 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟
5、 移入离心管4℃，约20,000g（约15,000转）15分钟
6、 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存
7、 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度
8、 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液
9、 沸水浴中3分钟
11、电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）
12、电转膜仪转膜（100mA 40分钟）
13、膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色
14、Westernblot 试剂盒显色
15、分析比较记录
二、Western Blotting 具体实验步骤
Western，也称Western blot、Western blotting、Western 印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western可以参考如下步骤进行操作：
1、收集蛋白样品(Protein sample preparation)
可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
2、电泳(Electrophoresis)
（1）、SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
（2）、样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X) 。100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
（3）、上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。
电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3、转膜(Transfer)
我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)或PVDF膜（二氟化树脂膜膜孔径：0.45um)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。
通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电压120V，转膜时间为30-60分钟。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
4、封闭(Blocking)
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以在4℃ 封闭过夜。
5、一抗孵育(Primary antibody incubation)
参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。
用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6、二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。
用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗，加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7、蛋白检测(Detection of proteins)
参考相关说明书，使用BeyoECL, Western 荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白。
洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。
8、膜的重复利用(Membrane recovery)
如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。
三、实验注意事项
1、 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上；
a. 转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡
b. 在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡
c. 将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极
d. 将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶
e. 按照厂家所示接通电源开始电泳转移
f. 转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶
2、 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置；
3、 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液；
4、 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时；
5、 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜
6、 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气；
7、 袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧；
8、 混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（2.5-5毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜）；
9、 用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml；
10、将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时；
11、按步骤9洗涤；
12、加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS），于室温下摇动；
13、Western Blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于Western Blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行Western Blot。实验中取胶和膜需带手套。
四、关于内参抗体
推荐产品：本公司自主研发的β-Actin肌动蛋白（抗体），产品编号：bs-0061R。
本公司的内参抗体bs-0061R具有以下特点优势：
1、经亲和层析纯化的浓缩液（或冻干粉），该抗体质量超过国外任何公司的同种产品；
2、用于Western Blotting为非常清晰的一条带稀释比达1：400；
3、用于免疫组化表达位置准确，特异性强、效价高；
4、分子量：42Kda，根据需要可提供各种不同的包装；
5、IgG含量为100μg/0.2ml 500ug/1ml；
6、价格仅为0.1ml/480.00元人民币；
7、只需4℃保存运输，有效期：-20℃液体长达两年（冻干粉状态长达5年以上）；
8、产品费用低 ，性能稳定、质量可靠、易于保存；
9、该抗体适用广泛，可用于人、羊、狗、猪、牛、兔、鸡和大、小鼠等动物种属蛋白检测；
众所周知，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的蛋白上样，才有比较的基础。特别是在表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以需要内参做对比。
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，以保证实验结果的准确性。
在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。 蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。
实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分，可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验，至内参量一致为止；若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点，但是可以保证结果更有说服力，更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。
五、实验中出现的问题及处理办法
1、为什么带出现拖尾现象？
原因：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的；
处理办法：加样前离心，选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制;降低凝胶浓度。
2、为什么带出现纹理现象？
原因：主要是样品不溶性颗粒引起的；
处理办法：加样前离心，加适量样品促溶剂。
3、为什么电泳的条带很粗？
原因：电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因；
处理办法：适当增加浓缩胶的长度，保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7），适当降低电压。
Western Blotting 问题解答
1、胶片上存在反转印象（如：亮的条带、黑的背景）？
原因：HRP的浓度过高；
解决：稀释HRP至少10倍。
2、膜上有黄色或棕色的沉积？
原因：HRP的浓度过高；
解决：稀释HRP至少10倍。
3、在暗室中条带过于明亮？
原因：HRP的浓度过高；
解决：稀释HRP至少10倍。
4、条带的发光时间持续了至少8小时？
原因：HRP的浓度过高；
解决：稀释HRP至少10倍。
5、信号太弱或没有？
1.太多的HRP积聚导致信号快速的消退；
2.抗原或抗体的浓度不够；
3.转印不成功；
4.HRP或其他底物的效价降低。
1.稀释HRP至少10倍；
2.增加其浓度；
3.寻找合适的转移方法和条件；
4.选择其他的合适底物。
6、背景高？
1.HRP浓度过高；
2.封闭无效；
3.不适合的封闭试剂；
4.洗涤不充分和洗涤液的量；
5.胶片曝光过度；
6.抗原或抗体的浓度太高。
1.稀释HRP至少10倍；
2.寻找合适的封闭方法；
3.选用其他的封闭试剂；
4.增加洗涤的时间,次数；
5.减少曝光时间；
6.稀释抗原或抗体。
7、蛋白质条带上有空泡影像？
1.蛋白质没有被充分转印；
2.膜没有预先浸湿；
3.在胶片和膜之间有气泡。
1.寻找合适的转移方法和条件；
2.在转印前充分浸湿；
3.在暴光之前赶走气泡。
8、胶片上背景弥散？
原因：HRP标记的抗体出现了积聚；
解决：稀释HRP至少10倍。
9、无特异性条带？
1.HRP浓度过高；
2.SDS促使非特异蛋白质条带黏附在目的蛋白质条带上。
1.稀释HRP至少10倍；
2.在操作过程中不要加SDS。
关于肽链的设计
多肽是大分子，每条多肽序列在物理和化学特性上都有自己的独特性。有些多肽合成起来很困难，还有些合成相对容易，但纯化困难，其主要是不溶于水，所以在纯化中，那些疏水肽必须溶于非水溶剂中或特殊的缓冲液，然而这些溶剂或缓冲液可能不适合应用于生物实验系统，研究人员不能使用该多肽达到研究目的。
博奥森公司的合成人员经多年的摸索和积累，对研究人员的多肽设计提供一些建议：
一、变难为易
1、减少序列长度
肽的长度增加导致粗产物纯度降低，小于15个残基的肽较容易得到.当肽链增加到20个以上时，正常产物的量就要考虑。在具体实践中残基低于20往往能得到更好的结果；
2、减少疏水残基
疏水残基占明显优势的肽，尤其在距C端7―12个残基的区域，会引起合成困难，一般认为由于合成中形成β折叠片，而产生不完全配对。当然，可用几个极性残基置换，或加入Gly或Pro易打开肽结构可能会得到帮助；
3、减少“难度”残基
有多个Cys、Met、Arg、Try残基一般难以合成，Ser通常可作为非氧化替换。
二、改善可溶性
1、改变N端或C端
酸性肽（pH值为7时带负电荷）我们提议；N端乙酰化C端保持自由羧基，以增加负电荷。碱性肽（pH值为7时带正电荷）C端氨基化N段自由氨基，以增加正电荷；
2、缩短或加长序列
某些序列含有大量疏水氨基酸，如Trp、Phe、Val、Ile、Leu、Met、Tyr、Ala等当这些疏水残基大于50%通常难溶解。为增加肽的极性，加长序列可能会有帮助。另外一种选择是通过减少疏水残基的方法降低肽链的长度以增加极性。肽链极性越高，就越有可能溶于水；
3、加入可溶性残基
对于一些极性氨基酸能改善可溶性。酸性肽可在N端或C端加上Glu-Glu.碱性肽可在N端或 C端加上Lys-Lys.若不能加入带电荷集团。可以将Ser-Gly-Zer加到N端或C端。但是，当肽链的两端不能改变时，此方法不行；
4、通过置换一个或多个残基改变序列
肽链的可溶性可通过改变序列某些残基来改善，一般对单个残基的替换就能显著改变其疏水性。而这种改变是较为保守的，如用Gly替换Ala；
5、选用不同“框架”来改变序列
如果能用某个序列制备许多长度一定的相互串联或重叠的多肽，可以通过改变各个多肽起始点的方法来实现改变序列的目的。其原理是：在同一多肽的亲水和疏水残基间创造新的更好的平衡，或将同一多肽的“困难”残基（比如将两个Cys）放进两个不同得多肽而不是集于同一个分子内。
多肽的溶解与保存
多肽有着很多特性，关于一些特殊肽您需要的有关信息可与博奥森公司的技术人员联系。当然首先建议您用少量肽来试验最适合的溶解方法，当多肽完全溶解后，才能加缓冲液（注意：应将多肽加入到适当溶剂中搅拌）。
一、冻干多肽的溶解
1、多肽溶解的主要问题是二级结构的形成。虽然疏水肽链二级结构的形成更明显，但除最短的肽链外，此现象产生在几乎所有肽链,与极性无关。所以，溶解多肽的第一个原则是使用无菌蒸馏水或去离子水，当然无氧水最好。多肽溶液可能遇到细菌降解，为防止此情况的发生，应溶解在无菌的蒸馏水中或用0.45或0.2孔径的滤膜过滤除菌。含有Cys、Met、Trp的多肽很容易氧化，应溶于无氧的水中，无氧水可通过注入惰性气体（氮、氦、氩）减压除气得到；
2、若多肽不溶于纯水，超声处理有助于打碎颗粒并增加溶解度。注意:超声处理会引起溶液发热或多肽降解；
3、若多肽含有多个碱性氨基酸，使用（1-10%）的乙酸水溶液：对于疏水性强的多肽，应使用50%的乙酸；
4、若多肽中含有大量酸性氨基酸，可用氨溶液（1-10%）或乙酸乙基吗啡或重碳酸盐等挥发性的碱性缓冲液溶解。pH值在层析前必须调整；
5、异丙醇和乙腈能溶解中等大小的多肽。若肽要上柱，有机溶剂的量必须很少否则将严重影响停留时间；
6、若多肽因含有Val、Leu、Met、Phe、Tyr、Ala等芳香链而高度疏水、或为中性肽时，DMF或DMSO等膜变性剂的使用，有利于多肽的溶解：
a.高浓度模变性剂通过破坏多肽的二级结构而助溶；
b.膜变性剂适于多肽分析液的制备，但可能会对其生物活性的研究工作造成干扰；
c.DMF是最佳变性剂（最高浓度可达30%），滴加至多肽溶解；
d.反相层析法时，DMF将与洗脱液前锋一起流出，根据入量的多少，峰值可能很高。大多数肽能在大量DMF流出后几分钟内流出，若肽链很小，洗脱太早，多肽的量将很低。
二、冻干多肽的保存
标有“冻干保存”说明的多肽应该保存在冰冻条件下，以-20℃以下最佳，其活性可保持多年。当使用干冻产品时，开盖前其容器应在装有新鲜干燥箱内升至室温。-20℃的产品，此过程需要一小时或更长，随保装而定。否则，当容器打开，水气进入导致凝缩而降低稳定性。一旦打开，应迅速称量完毕，立即封闭以免潮解，亲水肽更应注意。
三、溶解多肽的保存
多肽溶液比干粉的稳定性差很多，为了获得较好的效果，遵循以下原则：
1、分成小包装避免反复冻融。使用多少解冻多少；
2、溶于pH5-7无菌的缓冲液中，-20℃储存；
3、由于细菌能降解多肽，储存前应过滤细菌；
4、包含Cys、Met、Try、Glu、Asp的多肽易于氧化，因此应保存在无氧化剂的环境中。
酶标抗体效价测定程序
各种HRP酶标记成抗体的效价测定程序如下（如：羊抗鼠IgG-HRP的效价测定）：
1、抗原包板：15ug/ml 小鼠IgG-pH9.6·CB液 0.1ml/孔；
2、37°C包被60min或4°C过夜；
3、PBST洗板3次，5min/次；
4、加入倍比稀释的HRP标记抗体 0.1ml/孔；
5、37°C 30min；
6、PBST洗板5min/次×3；
7、底物液0.1ml/孔 37°C 5-10min；
8、终止液：2N H2SO4 0.05ml/孔；
9、450nm 测定OD值；
10、阳性OD值比对照值大3倍，为判断效价稀释度。
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