这是个机器人猖狂的时代，请输一下验证码，证明咱是正常人~TPR样蛋白生物学功能及作用机制的研究--《南京医科大学》2008年硕士论文
TPR样蛋白生物学功能及作用机制的研究
【摘要】：
第一部分NYD-SPl4一个新的TPR结构域样蛋白的功能研究
目的:通过研究一个本实验室发现的全新TPR样结构基因NYD-SP14及其与其他蛋白的相互作用,以进一步探讨NYD-SP14可能的生物学功能和在精子和肿瘤发生和发展过程中的作用机制。方法:构建一系列NYD-SP14、PP2A的A亚单位以及C亚单位、HRB2、HSP70、HSP90酵母表达载体、荧光表达载体和原核表达载体。通过RT-PCR分析NYD-SP14在多组织中差异性表达研究NYD-SP14与睾丸发育的关系。采用酵母双杂交技术和GST pulldown实验验证NYD-SP14与PP2A的A亚单位(PP2R1A)以及C亚单位(PP2AC)、HRB2、HSP70、HSP90的相互作用以及这些相互作用的明确位点,通过序列比对及与之相互作用的蛋白质推断NYD-SP14可能的生理学功能已经一步研究。通过体外原核细胞表达出NYD-SP14蛋白,纯化获得单一的His-NYD-SP14蛋白,将纯化好的NYD-SP14蛋白免疫Babla/C小鼠获得NYD-SP14多克隆抗体。NYD-SP14、HRB2荧光表达质粒转染HELA细胞稳定筛选后观察NYD-SP14、HRB2这两个在研究中发现的新的蛋白质在HELA细胞的表达定位。通过免疫组化观察NYD-SP14在睾丸及浸润性乳腺癌组织中的表达。结果:通过RT-PCR分析不同发育时期小鼠睾丸中NYD-SP14的表达量研究NYD-SP14与睾丸发育的关系,以证明该基因与细胞增殖相关。RT-PCR表明NYD-SP14在睾丸强表达于其他组织。酵母双杂交和GST pulldown验证NYD-SP14与HRB2、PP2A-A亚单位PP2R1A、PP2A-C亚单位(PP2AC)、HSP70、HSP90相互作用,而NYD-SP14包含的三联的TPR结构域对于这些相互作用是必需的,其中HRB2是一个从未被报道过的人KRR1蛋白质,这为研究SP14的功能和作用机制指明了方向。NYD-SP14与PP2R1A不同片段酵母双杂交共转染显示NYD-SP14的272～387氨基酸和PP2R1A的183-463氨基酸是必须的。通过定点突变实验,已证明了HSP70和HSP90未端的EEVD序列是与NYD-SP14结合所必须的。成功地构建了HELA细胞的GFP-NYD-SP14、GFP-HRB2稳定转染细胞株。绿色荧光蛋白的亚细胞定位试验,提示NYD-SP14在HELA细胞中,可定位于胞浆中,而HRB2在细胞分裂不同过程定位于不同的地方。结论:本实验室分离并获得一个新基因NYD-SP14,生物信息学分析表明NYD-SP14的N末端含有一个单独TPR结构域和由三个连续的TPR结构域组成的TPR结构区,提示NYD-SP14属于TPR样基因,其编码的蛋白很可能具有TPR样蛋白的生物学功能。NYD-SP14在睾丸和高度恶性的浸润性乳腺癌中高表达,提示NYD-SP14可能与细胞增殖相关,并有可能是一种肿瘤-睾丸(CT)基因。另外,本研究还表明NYD-SP14可以与HRB2、PP2R1A、PP2AC、HSP70、HSP90相互作用,NYD-SP14在细胞的发生过程中,可能起到一种桥梁作用,沟通起HRB2、PP2R1A、PP2AC、HSP70、HSP90这些似乎没有什么必然关系的蛋白间的相互作用,共同调节细胞的周期生长。这些研究有助于揭示精子和乳腺癌发生发展的分子机制,更为研发新的乳腺癌治疗药物提供理论指导。这些结果显示,HRB2的表达高低,不仅仅是参与40S核糖体的形成,可能还是细胞分裂的直接启动者。同时,也说明了,SP14、HRB2、PP2A Aa和HSP70所形成的复合物,可能参与调控了细胞的分裂。
第二部分TPR样蛋白介导的蛋白与蛋白相互作用的作用机制研究
目的:通过研究一系列包含有三联TPR的TPR样蛋白与PP2R1A、PP2AC、HSP70、HSP90的相互作用以及它们相互作用的明确位点,构建TPR样蛋白介导的蛋白与蛋白相互作用图,进一步分析TPR样蛋白与PP2R1A、PP2AC、HSP70、HSP90的相互作用的作用机制。
方法:构建64个包含有TPR结构域的TPR样蛋白基因全长及单独的三联TPR结构域突变体的酵母表达载体及GST-表达质粒。通过酵母双杂交和非同位素标记的GST pulldown实验验证这些TPR样蛋白与PP2R1A、PP2AC、HSP70、HSP90和HSP70与HSP90共同的C末端的EEVD结构的突变体的相互作用,构建以TPR样蛋白为中心的蛋白与蛋白相互作用图,进一步分析包含有三联TPR结构域的TPR样蛋白介导的蛋白与蛋白相互作用的机制和构建一种研究TPR样蛋白和进一步研究PP2R1A、PP2AC、HSP70和HSP90蛋白的模式。
结果:成功构建64种包含有三联TPR结构域的TPR样蛋白的酵母表达质粒。运用上述质粒与PP2R1A、PP2AC、HSP70和HSP90酵母表达质粒进行酵母共转染的双杂交实验,其中52种蛋白及其单独的三联TPR结构域区域突变体蛋白可以PP2R1A、PP2AC、HSP70和HSP90相互作用。构建这64种蛋白及其单独的三联TPR结构域区域突变体蛋白的GST-表达载体,通过非同位素标记的GST-pulldown实验验证了酵母双杂交的结果。结论:本研究共发现52种新的TPR样蛋白质与PP2R1A、PP2AC、HSP70、HSP90相互作用,因此推测对于包含有三联TPR的TPR样蛋白而言,它们和PP2A的相互作用具有普遍意义。另外,这些发现为研究与PP2R1A、PP2AC、HSP70、HSP90的作用的新的相互作用底物提供了一种新的研究模式。
【关键词】：
【学位授予单位】：南京医科大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2008【分类号】：Q51【目录】：
第一部分 NYD-SP14一个新的TPR结构域样蛋白的基因功能研究6-38
中文摘要6-8
英文摘要8-10
材料与方法12-27
第二部分 TPR样蛋白介导的蛋白与蛋白相互作用的作用机制研究38-62
中文摘要38-39
英文摘要39-41
材料与方法43-50
分析与讨论58-62
参考文献63-66
A testis-specific and testis developmentally regulated tumor protein D52(TPD52)-like protein TPD52L3/hD55 interacts with TPD52 family proteins72-93
综述93-115
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京公网安备75号葵花盘复合生物蛋白饲料的应用研究--《饲料研究》2010年12期
葵花盘复合生物蛋白饲料的应用研究
【摘要】：结合我国多年来生产生物蛋白饲料的经验,以产朊假丝酵母、米曲霉和康氏木霉组成复合菌剂,对利用向日葵花盘粉进行混合发酵来生产生物蛋白饲料的工艺和应用进行了研究。试验得到其最佳工艺条件为产朊假丝酵母、米曲霉和康氏木霉,按2:2:1配比成复合菌剂,1.5%的接种量加入到葵花盘粉固体发酵培养基中,发酵基质水分含量50%,以尿素为氮源,添加量1.5%,pH自然,30℃发酵48h后,产物中粗蛋白含量最高。所得生物蛋白饲料粗蛋白、粗脂肪、灰分、粗纤维和水分含量分别为15.45%、2.01%、8.64%、9.16%和20.39%,且有酒香味,适口性好。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：S816.35【正文快照】：
向日葵作为一种高产而且优质的经济作物,其种植在我国发展迅速,并且随着全世界对油料作物需求的不断增加,其在我国的种植面积也不断扩大。而向日葵花盘中的营养成分也因其品种、产地和收获时间不同会有较大的差异。向日葵花盘中粗蛋白质的含量为8%~15%。与秸秆干草相比,虽然
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