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靶向禽流感H5N1包膜蛋白进入抑制剂的筛选及机制研究
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下载文档:靶向禽流感H5N1包膜蛋白进入抑制剂的筛选及机制研究.PDF番石榴叶提取物抑制HIV包膜蛋白亚基gp41六股螺旋束形成的研究--《南方医科大学》2009年硕士论文
番石榴叶提取物抑制HIV包膜蛋白亚基gp41六股螺旋束形成的研究
【摘要】：
艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)又称获得性免疫缺陷综合征,是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)引起的传染性疾病。自从20世纪80年代首次报告艾滋病临床病例以来,艾滋病在世界迅速蔓延,目前在全球已呈爆发性流行趋势,对人口平均寿命和世界经济发展产生了巨大的影响,成为21世纪人类面临的最重大公共健康问题。艾滋病已经成为人类前所未有的最具毁灭性的疾病。至今,发达国家已投入了大量的资金及人力资源,对HIV本身以及抗HIV的药物进行研究。目前被批准用于临床的治疗AIDS的药物主要分为核苷类逆转录酶抑制剂(nucleocide reversetranscriptase inhibitors,NRTI)、非核苷类逆转录酶抑制剂(Non-Nucleoside ReverseTranscriptase Inhibitors,NNRTI)、蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor,PI)、整合酶抑制剂和进入抑制剂5大类,这些药物主要是通过和底物竞争结合酶或结合到酶上使之变性,抑制酶的活性,从而破坏HIV的生活周期,达到抑制病毒复制的目的。这些药物可以在一定程度上延缓病人病情的恶化,但并不能彻底清除患者体内的病毒。大部分病人一直生活在病毒低水平复制的状态中,长期用药患者将产生抗药性,并且一旦停止用药,病人体内病毒水平很快又恢复到甚至超过用药前的水平。
在HIV感染过程中,首先是HIV包被膜与靶细胞的细胞膜发生融合。HIV与靶细胞融合主要由包膜糖蛋白gp160(由包膜表面糖蛋白gp120和跨膜糖蛋白gp41非共价结合而成)介导。gp120与靶细胞上的CD4分子和辅助受体(趋化因子受体CCR5或CXCR4等)依次结合,导致gp41的构型发生改变,形成6股α-螺旋束核心结构,将病毒包膜与靶细胞膜拉近并发生融合,完成病毒进入宿主细胞的感染过程。因此,抑制融合过程中的任何一个环节,就能抑制HIV进入靶细胞,从而预防和治疗HIV的感染。gp120、gp41、CD4、趋化因子受体(CXCR4或CCR5等)均可作为HIV进入抑制剂的药物作用靶点。
由于化学药物在临床治疗中疗效不甚理想,而且副作用较大,于是我国医药工作者从祖国中医药宝库中寻求中医中药对艾滋病的治疗,从而推动世界各国从植物中筛查预防与治疗艾滋病的药物研究。在对中草药有效成分的分析研究中发现,一些中草药的多糖、皂苷、生物碱、黄酮以及蛋白质类物质可以抑制HIV复制,具有很好的抗HIV病毒活性。黄酮类(flavonoids)是一大类天然存在的具有抗病毒活性的化合物,研究发现其显示出对HIV良好的抑制活性。皂苷(saponin)是天然产物中一类重要的化学成分。皂苷具有多种多样且相当重要的药理活性和生物活性,如抗肿瘤、抗真菌、防治心血管疾病、降血糖和免疫调节等,从而显示出广阔的应用前景。挥发油也称精油(volatile oil),是存在于植物体中的一类具有挥发性、可随水蒸气蒸馏出来的油状液体的总称。挥发油在植物界分布极广,作为中药使用的植物就有数百种含有挥发油,尤其在菊科、芸香科、伞形科、姜科等科属中较为常见。挥发油具有抗肿瘤、抗菌、抗过敏和抗病毒作用,并具有一定的酶抑制活性。本实验主要研究从番石榴叶中提取的三种成分皂苷、黄酮及挥发油抑制HIV包膜蛋白亚基gp41六股螺旋束形成的作用。
从番石榴叶中提取出皂苷、黄酮及挥发油,研究三种提取物对HIV包膜蛋白亚基gp41六股螺旋束的抑制作用,为寻求新的抗HIV病毒进入抑制剂提供实验依据。
1.实验用HeLa细胞传代按1×10~5个/ml的密度用10%完全培养基接种于96孔培养板中,每孔种植100μl。继续培养24h后,细胞随机(随机方法参照文献[21])分组:对照组(control)及其他不同剂量组(皂苷、黄酮分为1 mg/ml、0.5 mg/ml、0.25 mg/ml、0.125 mg/ml、0.0625 mg/ml、0.03 125 mg/挥发油分为50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml),每组设4孔。用RPMI-1640基础培养基配制不同浓度药物,每孔加入100μl,干预24h后,MTT法测OD值,求出其半数细胞毒性浓度(median toxic concentration,TC_(50))。
2.予TC_(50)以下的不同浓度的皂苷、黄酮及挥发油,用夹心酶联免疫测定法(ELISA)检测番石榴叶提取物对HIV包膜蛋白亚基gp41六股螺旋束结构形成的抑制作用。N36和C34是从HIV gp41的NHR和CRH区衍生出来的多肽,二者在体外能形成类似gp41 NHR和CRH结合的螺旋结构。因此,抗gp41六螺旋束核心结构的活性可以用抑制N36和C34结合的作用来测定。
3.统计方法:运用SPSS13.0统计软件进行统计,所有数据均以均数±标准差((?)±S)表示。各组MTT比色法结果比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)。组间均数两两比较,若方差齐性,用LSD(Least Significant Difference)法;若方差不齐性,用Dunnett's T3方法。P＜0.05表示有显著差异。
1.MTT法测得各个不同样品浓度作用后的细胞存活率,药物的半数细胞毒性浓度(TC_(50))用PHARM/PCS-VERSION4软件计算得出:番石榴叶的三种提取物皂苷、黄酮、挥发油的半数细胞毒性浓度(TC_(50))分别为137.6μg/ml,71.62μg/ml,23.63μg/ml。皂苷、黄酮在最大浓度(1mg/ml)时细胞存活率分别为17.28%、14.53%,在最低浓度(0.03125mg/ml)时细胞存活率分别为93.32%、85.64%。挥发油在最大浓度(50μg/ml)和最低浓度(0.1μg/ml)时细胞存活率分别为25.39%、82.21%。
2.应用基于抗原抗体反应的夹心ELISA法对皂苷、黄酮及挥发油三种化合物进行了筛选,在终浓度为25μg/ml时皂苷与黄酮对HIV gp41六螺旋束结构形成有明显抑制作用,二者的抑制率都大于50%,而挥发油在终浓度为25μg/ml时的抑制率较低,低于50%,而且皂苷和黄酮组的抑制率显著高于挥发油组。挥发油组、皂苷组与黄酮组三组均数间都有显著差异(P＜0.0001)。组间两两比较显示,挥发油组与皂苷组、黄酮组比较均有显著差异(P＜0.001),皂苷组与黄酮组相比无显著性差异(P=0.507)。故在初步筛选后弃掉挥发油,皂苷和黄酮进一步做梯度稀释计算半数抑制浓度(IC_(50))。皂苷、黄酮稀释为25μg/ml、15μg/ml、2.5μg/ml、1μg/ml、0.25μg/ml五个浓度梯度,二者均在25μg/ml的时候抑制大部分gp41六螺旋束结构的形成,皂苷在2.5μg/ml时以及黄酮在1μg/ml时能够抑制部分六螺旋束结构的形成。二者相比较,黄酮的抑制作用比皂苷稍强。通过计算得皂苷和黄酮的半数抑制浓度(IC_(50))分别为5.65μg/ml、0.87μg/ml。这说明了皂苷和黄酮类化合物能够作用于HIV gp41抑制其形成六螺旋束核心结构,可能也在抑制HIV与靶细胞融合中发挥作用。
通过对提取的皂苷、黄酮类化合物及挥发油的筛选,发现皂苷及黄酮具有良好的抑制HIV gp41六螺旋束结构形成的作用。本研究为从中草药等天然产物来源寻找HIV进入抑制剂提供了借鉴和思路。
【关键词】：
【学位授予单位】：南方医科大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2009【分类号】：R285【目录】：
ABSTRACT7-13
第一章 番石榴叶有效成分的细胞毒性研究16-29
1 材料16-17
2 方法17-19
3 结果19-26
4 讨论26-29
第二章 番石榴叶有效成分的抑制HIV包膜蛋白亚基gp41六股螺旋束形成的实验研究29-37
1 材料29-30
2 方法30-31
3 结果31-34
4 讨论34-37
参考文献38-43
统计学证明47
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0001)供体膜和用其制造低分子量全色有机电致发光设备的方法0011)树脂制薄膜成型铸塑设备0012)膜图案及形成方法、电子设备和有源矩阵基板的制造方法0013)薄膜晶体管及其制造方法、其电路、电子器件及电子设备0014)一种用于真空制膜设备的活化气体装置0015)薄膜半导体器件、薄膜半导体器件的制造方法、液晶显示装置、液晶显示装置的制造方法、电子设备，电子设备的制造方法和薄膜淀积方法0016)利用等离子技术的高分子中和膜制造设备及其制造方法0017)制造拒水透气薄膜复贴面料的专用设备0018)制造半导体薄膜的方法及其所用设备0019)制膜方法及装置、设备制造方法及装置、设备及电子机器0020)薄膜晶体管、薄膜晶体管基板、电子设备及多晶半导体薄膜的制造方法0021)薄膜晶体管基板、液晶显示设备及其制造方法0022)复合结构物的制造方法、除杂处理设备、成膜设备、复合结构物和原料粉末0023)成膜设备和喷头清洁方法以及设备制造系统及设备0024)掩模保持结构、成膜方法、电光学装置的制造方法、以及电子设备0025)晶体薄膜、其制备方法、使用其的元件、电路以及设备0026)用于开关的膜片、其制造方法、薄膜开关以及输入设备0027)一种锂电池隔膜的制备方法及设备0028)形成厚膜用的糊料及其制造方法和过滤设备0029)膜图案的形成方法以及电子设备的制造方法0030)带内部吸管的充液塑料薄膜袋及其制造设备和方法0031)用于制造涂料的方法和设备以及用于制造膜的方法0032)制备大面积高温超导厚膜的方法和专用设备0033)形成图案的方法，薄膜晶体管，显示设备及制法和应用0034)一种真空镀膜成图方法、专用设备及制品0035)形成氧化锌膜的方法和设备以及制造光生伏打器件的方法和设备、0036)制造薄膜晶体管的方法及设备0037)采用基本单轴取向来制备横向拉伸膜的方法及设备0038)薄膜装置的制造方法、晶体管的制造方法、电光装置及电子设备0039)膜图案的形成方法、器件、电光学装置、电子设备、以及有源矩阵基板的制造方法0040)多层膜在线连续镀制设备的工艺布置0041)薄膜图案基板、器件的制造方法、电光学装置及电子设备0042)偏振膜组件、制造偏振膜组件及具有偏振膜组件的显示设备的方法0043)一种瓷质抛光砖纳米类防污材料的制膜设备0044)单晶碳化硅薄膜的制造方法及制造设备0045)通过压延整理制造塑料薄膜尤其是聚氯乙烯薄膜的方法及设备0046)薄膜晶体管及制造方法以及包括其的有机发光显示设备0047)制造具有通孔的印刷电路板、电子设备单元的方法以及挠性线路薄膜在这种设备单元中的应用0048)设备、膜形成方法及设备的制造方法0049)一种耐污染高机械强度管式复合膜的制备方法及专用设备0050)拉伸薄膜制造设备及双折射测定方法0051)制造整个地用收缩薄膜包覆的无托盘包装单元的设备0052)供体膜和用其制造低分子量全色有机电致发光设备的方法0053)掩模及其制法、成膜方法、电光学装置的制法及电子设备0054)薄片或薄膜形成轧辊、薄片或薄膜形成设备及拱起控制方法0055)在排列膜上形成多区域的方法以及相关产品和制造设备0056)生产吹胀薄膜的方法、所用的设备及其模塑制品0057)建筑装饰板材表面防污剂的制膜设备及方法0058)高密度聚乙烯厚膜吹制工艺及设备0059)塑料薄膜片材在吹膜机上双层复合的制作方法及其设备0060)多晶硅薄膜制造方法以及使用该多晶硅薄膜的设备0061)在铝合金制品上快速制备阳极氧化膜的方法及设备0062)薄膜晶体管电路器件及其制造方法、以及液晶显示设备0063)有机电激发光元件的制造方法薄膜移除设备及擦拭装置0064)聚烯烃系列树脂膜、其制备用的组合物、其制备用的组合物的制备方法以及其制备用的设备0065)制程设备剥膜机构0066)用于制备有机/无机薄膜的有机分子束沉积设备0067)一种电热膜的制造设备0068)薄膜晶体管、其制备方法和具有它的平板显示设备0069)膜分离制备金属热处理氮基气氛的方法及设备0070)一种用于制造胶膜线的生产设备0071)薄膜装置的制造方法、电光学装置和电子设备0072)硅基薄膜光电转换装置、及其制造方法和制造设备0073)甩胶喷雾热分解薄膜制备设备0074)一种双极膜电去离子制取超纯水的方法及其设备0075)薄膜晶体管的制造方法、使用该方法的液晶显示装置和电子设备0076)拒水透气薄膜复贴面料的制造方法及专用设备0077)用于制造向物体上施用清漆和颜料的膜的设备和方法0078)采用无掩模曝光设备制造薄膜晶体管基板的方法0079)甩胶喷雾热分解薄膜制备设备0080)用于制造石英膜的设备0081)一种制备双向拉伸的聚四氟乙烯薄膜的设备和方法0082)集尘设备膜片阀控制器0083)制备聚合物膜的方法和设备、聚合物膜、偏振片和液晶显示器0084)用于制造薄膜的化学汽相淀积设备的加热器0085)用于显示设备的薄膜晶体管阵列面板及其制造方法0086)薄膜拉伸设备以及溶液薄膜制造方法0087)POF热缩膜制造设备的稳泡装置0088)制造圆筒形多层合成树脂薄膜的过程和设备0089)利用离子束外延生长设备制备氮化锆薄膜材料的方法0090)制造具有透明导电膜的设备0091)超声起雾效应制备薄膜的大面积沉积设备0092)POF热缩膜的制造设备0093)薄膜、制备该薄膜的方法和设备、以及包括该薄膜的电子元件0094)用于制膜设备的多用途等离子体喷*0095)滤膜分离用的一种设备的滤膜组件、其应用及其制作方法0096)抛光体、抛光设备、抛光设备调节方法、抛光膜厚度或抛光终点测量方法及半导体器件的制造方法0097)用于制造电子薄膜元件的方法和设备以及电子薄膜元件0098)半导体膜的结晶方法和显示设备的制造方法0099)用热雾化附着法制备导电膜的设备0100)覆膜电气设备及其制造方法0101)膜图形形成方法、器件制造方法、光电装置和电子设备0102)薄膜层叠制品、薄膜电池、电容器、用于制造薄膜层叠制品的方法和设备0103)在铝轮毂上快速制备阳极氧化膜的设备0104)用于电解和氧化法处理废水的设备，此处所用的导电过滤膜，它的制造以及借助该装备和/或过滤膜处理废水的方法0105)用于真空镀膜设备溅射阴极的靶及其制造方法0106)具有阻挡隔膜的电子元件、显示装置、电子设备密封结构及制作电子元件的方法0107)用于制造低反射率薄膜的方法和设备0130)制造燃料电池膜电极组件的设备0140)控制由加工半导体的沉积设备所形成的膜层厚度的方法0141)薄膜半导体器件、电光装置及其制造方法和电子设备0142)导电膜的形成方法以及电子设备的制造方法0143)成膜装置、成膜装置系统、成膜方法、以及电子设备或有机电致发光元件的制造方法0144)膜形成方法、膜形成装置、液晶的配置方法、液晶的配置装置、液晶装置、液晶装置的制造方法、和电子设备0145)用于制造薄膜图案的设备以及应用该设备制造薄膜的方法0146)薄膜晶体管、其制造方法、显示设备及其制造方法0147)晶体薄膜、其制备方法、使用其的元件、电路以及设备0148)建筑装饰板材表面防污剂的制膜设备0149)环带、功能膜及它们的制造方法、包含该环带的设备0150)中频反应磁控溅射制备二氧化硅膜设备0151)管式多层膜及其制备方法和设备0152)切割角膜的自动手术设备及其切割刀片组件和控制组件0153)POF热缩膜制造设备的烘房风房组合装置0154)一种制造聚合物包膜控释肥料的工艺和设备0155)利用阴影掩膜进行电子器件制造的方法和设备0156)工业设备制备纳米复合超硬薄膜材料的方法0157)一种薄膜的制造方法和设备0158)电路图案、薄膜晶体管及电子设备的制造方法0159)生物、光双降解薄膜及其制备方法和设备0160)动态法光接枝与表面复合结合制备复合膜的方法与设备0161)静电吸盘、薄膜制造设备及制造方法和衬底表面处理方法0162)离子自组装薄膜的制备工艺及设备0163)甩胶喷雾热分解薄膜制备设备0164)干燥涂布膜的方法和设备以及制造光学膜的方法0165)用于制造类金刚石薄膜涂敷的塑料容器的设备及其制造方法0166)离型膜及其制作工艺和设备0167)薄膜光波导和其制造方法以及电子设备装置0168)半导体薄膜、薄膜晶体管、及其制造方法和制造设备0169)超声快速沉积法制备纳米氧化物透明导电膜的设备0170)半导体设备、薄膜晶体管基板以及显示设备及其制备方法0171)制取高纯度肌醇的离子膜法及其设备0172)管状膜，制造管状膜的方法和使用管状膜的成像设备0173)强取向磁薄膜、由其制造的记录介质、传感器、设备及其制造方法0174)成膜方法及装置、基板的制造方法及装置以及电子设备0175)中空纤维膜的制备方法以及制备设备0176)使用压电膜制造膜式扬声器的方法及具有其的音响设备0177)双极性膜电渗析法制备有机酸的设备与工艺0178)等离子体CVD薄膜形成设备以及制造镀覆有CVD薄膜的塑料容器的方法0179)管状膜，制造管状膜的方法和使用管状膜的成像设备0180)用于制造包覆有DLC薄膜的塑料容器的设备0181)一种包装膜拉线制造设备0182)薄膜图形形成方法及器件制造方法、光电装置及电子设备0183)采用薄膜组织界面装置在生物膜中制作微孔的设备及方法0184)超声快速沉积法制备纳米氧化物透明导电膜的设备及方法0185)润滑剂组合物及用所述润滑剂组合物涂覆的制品、用于使电子基底成型的压模、用于使电子基底成型的成型设备、用于使电子基底成型的方法、及润滑膜的形成方法0186)耐热型聚酰亚胺薄膜复合套管及其制备方法和设备0187)用于制造液晶显示设备的薄膜晶体管的方法0188)火焰喷雾热分解薄膜制备设备0189)制造具有双侧表面结构的膜或层的方法和设备0190)在改进的轮胎膜具中制造充气轮胎的方法和设备0191)多层介质膜滤光镜及其制造方法以及固体摄像设备0192)打印设备、色带薄膜、及色带移动控制装置、方法和程序0193)含填料的双轴取向聚合物薄膜的制造方法及其设备0194)图形形成方法，薄膜晶体管、显示器及其制造方法及电视设备0195)制造薄膜晶体管液晶显示器的绝缘薄膜的组合设备0196)扬声器用振动膜及其制造方法、使用该振动膜的扬声器及使用该扬声器的设备0197)组合元件分离方法、薄膜制造方法和组合元件分离设备0198)薄膜样品测量方法和设备及薄膜样品制备方法和设备0199)电荷嵌镶膜、其制备方法、使用方法以及安装有该膜的设备0200)一种用于制造熔融碳酸盐燃料电池隔膜材料的锂酸铝粉末的制备设备0201)制造带有锥形平顶侧壁膜的半导体设备的方法0202)膜形成方法、光电装置的制造方法及电子设备0203)薄膜载带、带载半导体装置组件、半导体装置及其制造方法、封装基板和电子设备0204)玻璃丝包复合薄膜绕包电磁线制造设备0205)电声变换器用振膜及其制造方法、使用该振膜的电声变换器和设备0206)光波导膜及其制造方法、包含它的光电混载膜及电子设备0207)配向膜平台、配向膜制程及配向膜制程设备0208)一种彩色碳基薄膜的制备方法和设备0209)掩模、薄膜晶体管基板、制造基板的方法和显示设备0210)一种单向透光玻璃真空镀膜方法、专用设备及制品0211)制造微孔膜的挤出方法和设备0212)具有用于制造由热收缩膜制成的筒形标签的超声波熔接设备的贴标签机以及熔接方法0213)薄膜晶体管基板及其制造方法和具有其的显示设备0214)制造取向膜的制造装置、液晶装置以及电子设备0215)采用微波等离子法连续制成大面积功能淀积薄膜的方法以及适用该方法的设备0216)减压干燥方法、功能膜及电光学装置的制造方法以及设备0217)一种耐污染性聚乙烯醇复合膜的制备方法及其专用设备0218)高分子溶液静电纺丝制备纳米纤维膜方法和其实施设备0219)切割角膜的自动手术设备及其切割刀片组件和控制组件0220)一种原位沉积制备全固态薄膜锂电池的设备和方法0221)光学多层膜滤波器及其制造方法和电子设备装置0222)无机氧化物膜的处理方法、电子设备用基板及其制造方法、液晶面板及电子机器0223)有机电激发光元件的薄膜制作方法及其成膜设备0224)制造类双向拉伸热塑性塑料筒状薄膜的设备0225)农业及园艺用无水滴合成树脂薄膜制造方法及其制造设备0226)增强型复合材料中空膜的制造方法及设备0227)在基带上制多层膜的设备和方法0228)金属膜电容器和其所用金属化膜的制造设备和方法0229)防眩光膜及其制造方法，偏振部件及应用该偏振部件的显示设备，和内部漫射膜0230)制备碳纳米管薄膜的等离子体增强光热化学气相沉积设备0231)形成薄膜的方法、制造器件的方法、光电装置和电子设备0232)含高介电常数绝缘膜的半导体设备和该设备的制造方法0233)从合金型热塑性聚合物制造定向膜的方法，用于此制程的设备及制成的产品0234)将镜面印制膜施加到假肢器官或矫形装置上的方法及设备和具有假肢器官或矫形装置的装置0235)薄膜集成电路及制造该薄膜集成电路、CPU、存储器、电子卡和电子设备的方法0236)形成图案的方法，薄膜晶体管，显示设备及其制造方法，以及电视设备0237)抗反射隔膜及制造、显示设备、光学存储媒体及太阳能转换装置0238)制造倾斜取向薄膜的方法，倾斜取向薄膜及使用该膜的图像显示设备0239)绝缘性靶材及其制造方法、导电性复合氧化膜及设备0240)薄膜电路装置、电子设备和制造方法0241)处理基片的方法、形成膜的方法以及制造电子源的方法和设备0242)制造取向膜的制造装置、液晶装置以及电子设备0243)尤其在管状袋包装机中用于横向焊接和切断热塑性塑料薄膜制的包装用软管的设备0244)连续制造电子薄膜组件的方法和设备及电子薄膜组件0245)薄膜晶体管，用于制造薄膜晶体管的方法和具有该晶体管的电子设备更多技术请联系咨询！
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