荧光定量pcr引物设计原理_好搜问答
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荧光定量pcr引物设计原理
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在做荧光定量PCR预试验，先用普通pcr仪器跑的，模板是用CDNA。在设计引物的时候是不是必须俩个外显子跨过一个内含子？就是上下游引物必须落在俩个外显子上？？我就按这个设计的引物，但引物软件上设计的很好，可就是跑不出来，求高手指点。想问下不跨内含子直接在一个外显子上设计引物会不会影响后面荧光定量PCR的结果
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貌似我做的时候引物没有考虑那么多
似乎只要是在保守序列里的就可以
所以引物会有很多组组合。
我一直以来跑PCR后 电泳也没发现带
一般是摸版或者引物的问题几率比较大 用微信扫描二维码分享至好友和朋友圈分享到：
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第9天生活就像海洋，只有意志坚强的人才能达到生命的彼岸。知道了荧光定量PCR的CT值太高(荧光定量,目的基因,引物浓度,梯度)
19:46:29&&&来源：&&&评论：&&
[荧光定量PCR的CT值太高(荧光定量,目的基因,引物浓度,梯度)] 小弟最近在做荧光定量PCR，发现无论是actin还是目的基因的CT值都很高（30多），目的基因30多也就罢了，actin不会这么高啊！
我先后做过以下调整：1、增加模板浓度，稀释10倍、5倍、2倍，不稀释的都试过，没有什么质的变化2、增加引物浓度，做了一个梯度，发现变化也不大3、怀疑是逆转录试剂盒不行，换了另一个进口试剂盒（promega）还是老样子4、重新测了一下提取的RNA，浓度和纯度都可以 关键词:[荧光定量 目的基因 梯度 引物浓度 模板浓度 逆转录试剂盒 上下游引物]…
小弟最近在做荧光定量PCR，发现无论是actin还是目的基因的CT值都很高（30多），目的基因30多也就罢了，actin不会这么高啊！
我先后做过以下调整：1、增加模板浓度，稀释10倍、5倍、2倍，不稀释的都试过，没有什么质的变化2、增加引物浓度，做了一个梯度，发现变化也不大3、怀疑是逆转录盒不行，换了另一个进口盒（promega）还是老样子4、重新测了一下提取的RNA，浓度和纯度都可以（A260/280=1.9左右5、引物blast了，很好。溶解曲线也是单峰，Tm在90左右。6、操作应该不会有什么大的失误现在实在不知道哪里出了问题。。。。求各位高手帮我想想是哪里出了问题我的体系如下：10ul 染料（Go Taq Mix，promage公司）、2ul cDNA（不稀释）、上下游引物各0.4ul、补水至20ul
回复发现一个问题，溶解曲线虽然是单峰，但是纵坐标的Rn的值很高，别人的都是小于0.1，我的1-5. 是不是这个原因啊？回复你actin的产物预计是多少bp？跑过胶看看没？建议换一对引物。回复你actin的产物预计是多少bp？跑过胶看看没？建议换一对引物。好像是200 bp左右，没有跑过胶，我试试看吧回复好像是200 bp左右，没有跑过胶，我试试看吧200bp对于Real-time PCR太大了，一般来说是几十个bp最合适。个人认为还是引物的问题。另外不排除RNA提取过程和逆转录过程中DNA的污染，建议先用DNAse处理后再进行逆转录。回复小弟最近在做荧光，发现无论是actin还是目的基因的CT值都很高（30多），目的基因30多也就罢了，actin不会这么高啊！
我先后做过以下调整：1、增加模板浓度，稀释10倍、5倍、2倍，不稀释的都试过，没有什么质的变化2、增加引物浓度，做了一个梯度，发现变化也不大3、怀疑是逆转录试剂盒不行，换了另一个进口试剂盒（promega）还是老样子4、重新测了一下提取的RNA，浓度和纯度都可以（A260/280=1.9左右5、引物blast了，很好。溶解曲线也是单峰，Tm在90左右。6、操作应该不会有什么大的失误现在实在不知道哪里出了问题。。。。求各位高手帮我想想是哪里出了问题我的体系如下：10ul 染料（Go Taq Mix，promage公司）、2ul cDNA（不稀释）、上下游引物各0.4ul、补水建议先进行普通的PCR，用actin鉴定模板的质量。循环数设在22-26之间，跑胶后，看ACTIN的表达情况，再分析原因。回复首先做半定量来检验一下引物和体系，其次定量需要对模板进行稀释（以10的指数）做标曲。引物长度不是问题，片段短当然更好。纵坐标的阈值是可以手动调节的，有个计算公式。国产和进口试剂的阈值是不同的回复今天跑了一次胶，如上图所见。前两道是actin，后四道是目的基因。95度15秒，60度1分钟，四十个循环。个人感觉cDNA模板和引物应该没有问题。难道是荧光的机器坏了？我用的是AB7500.各位大侠实验室的荧光定量PCR机器多长时间维修一次？回复好像是引物的问题，请重新设定引物看看，呵呵！第6和第7到RT-PCR的CT值和其他两个有区别吗？回复好像是引物的问题，请重新设定引物看看，呵呵！第6和第7到RT-PCR的CT值和其他两个有区别吗？第六和第七道我没有加样啊。请问是如何看出引物有问题呢？回复有可能是RNA降解的原因，建议将RNA跑个电泳看看。回复奥，呵呵，我以为你actin 4个也对应着有4个目的扩增片段哪，呵呵回复请问各位大侠做实时荧光定量PCR，你们的模板c 10微升体系的，一般稀释多少呢？还是要自己摸索啊回复做实时荧光定量PCR最好不能低于20ul体系，不然荧光信号不稳定。回复求指教，我最近也遇到了与楼主同样的问题，why回复求指教，我最近也遇到了与楼主同样的问题，why引物特异性差，重新设计引物，多设计几条
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荧光定量PCR如何消除非特异性扩增
最近在做土壤微生物的绝对荧光定量，总是出现非特异性扩增，溶解曲线有两个峰，一个比较高一个低一点，引物是在英文文献中找的通用引物，普通PCR扩增的条带挺好的，做荧光定量的时候总是出现非特异性扩增，请高手帮忙如何除掉非特异性扩增，我用的是20ul的体系，引物0.2ul（10M），染料天根的9ul，模板浓度没测，用的2.5ul ,退火温度从63到67都试过，都有非特异性扩增，循环现在是30个。
既然提高退火温度没有改善，那多半还是引物特异性的问题。加上你是用荧光染料做的，没有特异性，那么普通PCR电泳跑不出来的条带，但出现多个信号是正常的。文献中的引物序列只能参考。建议仔细分析序列后设计特异性更高的引物。 : Originally posted by reallpf at
既然提高退火温度没有改善，那多半还是引物特异性的问题。加上你是用荧光染料做的，没有特异性，那么普通PCR电泳跑不出来的条带，但出现多个信号是正常的。文献中的引物序列只能参考。建议仔细分析序列后设计特异性 ... 你好，做土壤微生物的一般都是找的通用引物，不是自己设计的，我今天发现，我的荧光定量的这两个峰一个是标样的，一个是未知样品的，我上传一张图给您看一下，高的那个峰是标样，矮的那个是未知样品。这样感觉不像是非特异性扩增，就是我的标样和位置样品的峰不重叠。这个是由于什么原因造成的啊
QQ图片04.jpg 你有没有做标准曲线啊？ 上一张标曲的图看看，最大稀释浓度是多少？CT值最大是多少？
可能是操作过程中被污染了，因为荧光定量的灵敏度非常高，你下次把枪全都消毒好，紫外灯照射，加完其他东西后再加样品，在超净台里面做，把样品放在外面，最后再加。 : Originally posted by yabing0324 at
你有没有做标准曲线啊？ 做了啊，标线没往上弄，我稀释的是从20.6-2.06*10-6ng/ul，ct值没有超过30的， : Originally posted by yabing0324 at
上一张标曲的图看看，最大稀释浓度是多少？CT值最大是多少？
可能是操作过程中被污染了，因为荧光定量的灵敏度非常高，你下次把枪全都消毒好，紫外灯照射，加完其他东西后再加样品，在超净台里面做，把样品放在外 ... 把枪头什么的都高压灭菌吗，样品等其他的在 超净工作台里加完了，在在外面加吗，为什么样品要拿到外面加啊，这个溶解曲线的图是我试样的时候做的，就做了几个浓度的，想看看条件行不行 在参考文献的基础上对引物进行一定的修改 : Originally posted by jerryzyy at
把枪头什么的都高压灭菌吗，样品等其他的在 超净工作台里加完了，在在外面加吗，为什么样品要拿到外面加啊，这个溶解曲线的图是我试样的时候做的，就做了几个浓度的，想看看条件行不行... 一直把样品放在外面是防止你开盖的一瞬间有些样品漂到空气中，造成污染 RT-PCR的非特异性扩增的原因与对策
1.&&RNA中有内源或外源DNA污染
2. 引物和模板非特异性退火
3. 基因特异性引物设计较差
4. 形成引物二聚体
5. 镁离子浓度太高
1. 用扩增级DNase1处理RNA,使用抗气雾剂的吸头和UDG酶。
2. cDNA合成中使用基因特异性引物，使用递减PCR。
3. 遵循用于PCR扩增引物设计的同样原则设计出专一性更强的引物。
4. 设计在3’端没有互补序列的引物。
5. 优化镁离子浓度。 : Originally posted by yabing0324 at
一直把样品放在外面是防止你开盖的一瞬间有些样品漂到空气中，造成污染... 好的，谢谢 : Originally posted by 凌波丽 at
RT-PCR的非特异性扩增的原因与对策
1.&&RNA中有内源或外源DNA污染
2. 引物和模板非特异性退火
3. 基因特异性引物设计较差
4. 形成引物二聚体
5. 镁离子浓度太高
1. 用扩增级DNase1处理RN ... 我做的是绝对定量，做的时候用的是染料，没有单独加镁离子啊 : Originally posted by jerryzyy at
你好，做土壤微生物的一般都是找的通用引物，不是自己设计的，我今天发现，我的荧光定量的这两个峰一个是标样的，一个是未知样品的，我上传一张图给您看一下，高的那个峰是标样，矮的那个是未知样品。这样感觉不像 ... 这个图还是不错的，峰型比较明显。温度来看，大约差异2度。你用的是通用引物，所以特异性和产物单一性应该是可以保证的。
回到你的结果，定量PCR的溶解曲线结果往往会因为产物序列的一个或某几个碱基的变异就会造成你结果的差别。所以建议将你的PCR产物送出测序，利用通用引物，然后仔细分析测序结果。
个人建议 分析了下LZ的图，看起来可能是三个原因：
其一是引物设计有问题，特异性可能不好，产生引物二聚体，导致非特异性条带产生
其二是污染，有杂质带入，影响结果
其三是很容易被忽视的问题，就是盖盖子时要换手套，荧光定量PCR对盖子的透光性很敏感，盖子上有异物也会影响结果 : Originally posted by reallpf at
这个图还是不错的，峰型比较明显。温度来看，大约差异2度。你用的是通用引物，所以特异性和产物单一性应该是可以保证的。
回到你的结果，定量PCR的溶解曲线结果往往会因为产物序列的一个或某几个碱基的变异就会造 ... 您的意思是我的标线的序列和未知样品的序列长度一样，碱基序列不一样吗？ 你好！我最近在做土壤微生物的QPCR ，想向您请教一下如何做标准曲线的问题……我qq，跪求大神传授经验，嘿嘿！ 您好，我最近也在做土壤微生物QPCR,但是困在了标曲这块，想请问您一些关于制作标曲的问题！我理解的制作标曲的步骤是：提取土壤基因组；引物扩增；扩增片段与载体连接转入感受态中；从中筛选几个阳性克隆去测序。我想请教的是，这个方法对不？另外为什么要筛选几个阳性克隆？希望您能指导一下，另外希望您给帮忙推荐几篇详细介绍的文章，嘿嘿…… 这种情况的话～我觉得应该从一下几个方面入手：
1.先NCBI比对一下通用引物的特异性，看看是不是引物设计的就在一些乱七八糟的物种里面有非特异性的现象;
2.把你现在的定量PCR扩增产物跑一块胶，看一下你扩增出来的目的条带都是在多长的范围，要是非特异在100一下的话，那就是引物二聚体了～这个就没影响，要是需要严格定量的，设计个探针就OK了；
3.要是不想设计探针，而且在别的物种里面还有些许的同源性的话，可以尝试一下优化反应体系，优化一下体系中离子的浓度，换个MIX试试。
有问题继续沟通，预祝楼主实验顺利哈:work: 楼主最后的问题是怎么解决的，是引物的问题吗？}