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你可能喜欢通过RT-PCR 获得了一段保守序列 接着如何设计RACE引物 - 实验交流 - 生物秀
标题: 通过RT-PCR 获得了一段保守序列 接着如何设计RACE引物
摘要: [通过RT-PCR 获得了一段保守序列 接着如何设计RACE引物] 如题我要做的是一个未知基因， 依据已知物种的 对比设计出了引物，做了RT-PCR获得了大约500bp的片段，现在要获得全长，做RACE。 kit 中说设计3‘和5’引物各为sense 和antisense 引物，我现在又个很纠结的问题，一般测序结果的序列是正链还是负链呢？ 怎么知道测序结果是从5 关键词:[引物 序列 测序结果 测序 保守序列 正义链 正链]……
我要做的是一个未知基因， 依据已知物种的 对比设计出了引物，做了RT-PCR获得了大约500bp的片段，现在要获得全长，做RACE。
kit 中说设计3‘和5’引物各为sense 和antisense 引物，我现在又个很纠结的问题，一般测序结果的序列是正链还是负链呢？ 怎么知道测序结果是从5‘到3’ 还是从3‘到5’呢？然后怎么设计引物？
我的电脑装的是win732位的，可以装PP5吗？ 装了个PP6好像不好用
我是RACE新手 请教各位大虾！！！:tiger06:回复我最经也要做RACE，但也是新手呀，刚刚看了下3‘和5’RACE的原理和步骤，算是懂一点了，但不知道到时实验做起来会怎么样，祝我俩好运吧！回复
我最经也要做RACE，但也是新手呀，刚刚看了下3‘和5’RACE的原理和步骤，算是懂一点了，但不知道到时实验做起来会怎么样，祝我俩好运吧！ 那请问你的引物是如何设计的呢？一般测序结果的序列是正链还是负链呢？我很想知道这个问题的答案谢谢回复怎么没有人回复呢是问题太低级吗:tiger08:回复公司测序回来的结果都是由5‘到3’端的，你在设计3‘端和5’端的时候需要设计两个特异引物，做巢式PCR。3’端正向，5‘端为反向互补，满足引物设计原则就可以了回复我跟lz也要做相同的东西，纯新手，希望以后交流。。。:hand:回复
那请问你的引物是如何设计的呢？一般测序结果的序列是正链还是负链呢？我很想知道这个问题的答案谢谢 就是根据模板链设计的啊，测序结果都是正链，5‘到3’的！回复
公司测序回来的结果都是由5‘到3’端的，你在设计3‘端和5’端的时候需要设计两个特异引物，做巢式PCR。3’端正向，5‘端为反向互补，满足引物设计原则就可以了 我用的是 PCR产物结果直接去测序的 也是5‘到3’吗？回复
公司测序回来的结果都是由5‘到3’端的，你在设计3‘端和5’端的时候需要设计两个特异引物，做巢式PCR。3’端正向，5‘端为反向互补，满足引物设计原则就可以了 表示我也是要做RACE的新手，我连原理都木有看明白，5‘端的RACE和巢式PCR的关系是神马？引物设计还是和设普通引物一样么？回复
我最经也要做RACE，但也是新手呀，刚刚看了下3‘和5’RACE的原理和步骤，算是懂一点了，但不知道到时实验做起来会怎么样，祝我俩好运吧！ :hand::hand:我也是新手，同道中人！多多交流哈！回复这个问题我也觉得很纠结其实我觉得正反链都不好判断，我一般是通过看看这个序列能不能找到特异的ORF，如果有的话就行，没有的话就反义过来回复同新手，但我觉得lz不用管测序结果是那条链，你按照你自己已有的保守序列做引物就是了，测序结果你拿来做比对嘛，比对不上就拿互补序列做比对嘛
我觉得是这样的，lz这个问题若解决了，可以说一下怎么解决的么，大家交流一下回复呵呵，很简单的一个问题，把目的基因放到ncbi上比对，和同源基因相比，看她和其他的同源基因的位置在哪里，第二，排序是不是也是从低到高。回复我也是新手，请问特异引物到底要怎么设计啊？3’RACE的引物是上游还是下游引物啊？
我是通过几个物种比对后获得保守序列，设计特异引物获得了保守区，想用RACE来获得全长，但是怎么设计RACE引物，搞不清，到底怎么根据我测序获得的序列来设计RACE引物，忘各位大侠指教。回复
我也是新手，请问特异引物到底要怎么设计啊？3’RACE的引物是上游还是下游引物啊？
我是通过几个物种比对后获得保守序列，设计特异引物获得了保守区，想用RACE来获得全长，但是怎么设计RACE引物，搞不清，到底怎么 ... :hand:同问！回复
:hand:同问！... 我已经做完实验，分享下心得，其实RACE引物的设计不难，首先要搞清楚不论是5"还是3"，都是以正义链来看方向的，所以3"RACE的引物是以反义链为模板，朝正义链3"的方向走（其实也想当于我们平时设计的上游引物），只要把这个方向问题搞清除了，其他就是按照它的原则，比如GC含量50%-70%，Tm值高于65度等，盒说明书上的要求来就可以了。5"同理。希望对你有帮助回复
我已经做完实验，分享下心得，其实RACE引物的设计不难，首先要搞清楚不论是5"还是3"，都是以正义链来看方向的，所以3"RACE的引物是以反义链为模板，朝正义链3"的方向走（其实也想当于我们平时设计的上游引物），只 ... 多谢！请问你3‘用盒没？我想了解一下具体过程，包括各体系成分的浓度，用量等。回复現在大部分都是用SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit User Manual 這組方便又快速，方法步驟跟試劑protocal裡面都寫得很清楚。簡單的說...
5"RACE :primer設計在為Reverse
3"RACE: primer設計在為Forward
然後將5"跟3"回來的序列對成一段全長的序列ATG...............TAA (CDS)
之後就看你要做甚麼瞜^^回复测序结果的序列取决于你是用上游还是下游引物设计，上游引物作为测序引物结果就是正链，下游引物就是负链。但最终结果是一致的，反向互补一下就可以了。回复
我已经做完实验，分享下心得，其实RACE引物的设计不难，首先要搞清楚不论是5"还是3"，都是以正义链来看方向的，所以3"RACE的引物是以反义链为模板，朝正义链3"的方向走（其实也想当于我们平时设计的上游引物），只 ... 我已得到了800bp作用的序列，现根据其设计了3‘RACE的引物，用的是宝的3’full RACe试剂盒，可以吗？之前做了两次没成功，也不知道是什么原因。做race的引物要很靠近末端吗？一般最大距离可到多少啊？我5‘end还有700多bp没测出，可做5’RACE吗？新手，请指导……
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官方公共微信想问下各位高人,设计引物时没有所找物种的基因序列,想问下怎么进行多物种序列比对,找到相对保守区域呢希望各位能给与详细指导,谢谢大家_百度作业帮
想问下各位高人,设计引物时没有所找物种的基因序列,想问下怎么进行多物种序列比对,找到相对保守区域呢希望各位能给与详细指导,谢谢大家
想问下各位高人,设计引物时没有所找物种的基因序列,想问下怎么进行多物种序列比对,找到相对保守区域呢希望各位能给与详细指导,谢谢大家
找近缘种,越近越好,的那个基因
都下下来ncbi或软件都可以比对,找高度保守区 具体操作为,蛋白序列和DNA序列都下,从连着7-8个蛋白保守区处比着DNA设计引物, 如果有四个是G,两个是A就选G,
要是一半一半就设计简并引物.一个引物简并引物不能超过3个!当前位置： >
摘要 : 简并引物设计的方法(包括实际操作步骤)简并引物是指用来编码一段短肽序列的不同碱基序列的混合物。主要用来同源克隆未知的基因，或用来分析某一种基因多态性的一种方法。
　　简并引物设计的方法(包括实际操作步骤)简并引物是指用来编码一段短肽序列的不同碱基序列的混合物。主要用来同源克隆未知的基因，或用来分析某一种的一种方法。
　　简并的常见程序如下：
　　1. 利用搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列。
　　因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。
　　2. 对所找到的序列进行多序列比对。
　　将搜索到的同一的不同氨基酸序列进行多序列比对，最好采用局部比对程序如BLOCK，也可选工具Clustal W，也可在线分析www.ebi.ac.uk/clustalw. 其结果如下图所示，所有序列的共有部分将会显示出来。“*”表示保守，“：”表示次保守。
　　3. 确定合适的保守区域。
　　设计至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50~400个氨基酸为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基酸，因为每条引物至少18bp左右。
　　若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个氨基酸的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。最终目的就是至少有两个6个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。
　　4. 利用软件设计。
　　当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，如利用pp5进行简并引物的设计。将参与多序列比对的序列中的任一条导入pp5中，再将其翻译成核苷酸序列，有密码子简并性，其结果是有n多条彼此只相差一个核苷酸的序列群，该群可用一条有简并性的核苷酸链来表示(其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/T，H=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G， D=A/G /T，N=A/C/G/T)，该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在pp5中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。
　　最好使用专门的简并引物设计方法如：CODEHOP bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html
　　GeneFisher2 bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/
　　在这里我们特别值得说明的是CODEHOP方法，该方法要求的保守区较短，而且能有效的降低引物的兼并度，是一种非常有效的方法。该方法主要是通过将简并区放在3&末端，并在5&端设计一个一致性的区域来降低兼并度。
　　5. 对引物的修饰
　　若得到的引物为：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3，则其简并度=4&2&4&3&4&3&2=2304，很明显该条引物的简并度太高不利于pcr。我们可以通过用次黄嘌呤代替N(因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对)和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度。
　　注意：该方法设计出来简并引物对，适用于用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。
　　引物中符号说明：
　　A代表A
　　C 代表C
　　G代表 G
　　T 代表T
　　M 代表A or C
　　R 代表A or G
　　W代表 A or T
　　S代表 C or G
　　Y代表 C or T
　　K代表 G or T
　　V 代表A or C or G
　　H 代表A or C or T
　　D代表 A or G or T
　　B 代表C or G or T
　　N代表 G or A or T or C
　　由于引物的简并性的问题，所设计的引物通常简并性过高，导致有效引物利用率降低，PCR产物非特异性增高。
　　虽然减少简并引物长度可以相对减少简并性，但随之而来的问题是引物的Tm值过低，有时不得不设计第二对引物对PCR产物进行二次扩增，即巢式PCR，或者需要与Touchdown PCR相结合使用。
　　与通常设计的简并引物不同，利用CodeHop方法设计简并引物。引物由两部分组成：引物3&端为根据4-5个保守氨基酸设计的核心简并区(3&core region)，长度只有11-15个碱基;引物5&端为非简并性夹板结构(5&consensus clamp region)。5&端夹板结构是根据密码子偏向性设计的一致性序列，它最大程度的预测了保守性氨基酸的编码序列，其长度取决于所需的退火温度。这样设计的优点在于既减少了引物的简并度，又提高了引物的退火温度，保障了PCR产物的特异性。标准简并PCR在聚合反应的晚期，随着产物的增多，引物的非特异性结合的现象增多;而CodeHop PCR的晚期，这种现象大为减少。实验结果表明，按这种方法设计的简并引物非特异性扩增减少，是一种快捷方便的简并引物设计方案。
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