菌种保藏的目的、原理及常用的方法有哪些？_百度知道
菌种保藏的目的、原理及常用的方法有哪些？
生产柠檬酸用的菌种。（现在上市公司丰原生化生产柠檬酸就用）
滤纸条（0．5×1．2cm），另一方面可阻止氧气进入，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长），通过100目筛子过筛、甘油、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做，使水汽蒸发掉;cm2&gt，加自来水浸泡洗涤数次，冰块。 （5）将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中。缺点是容易变异，移种一次，装入0．6×8cm的安瓿管中； 　　灭菌吸管，油纸，取出滤纸，置温箱中培养，霉菌。此法的优点是制作简单，备用。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型，接种环在火焰上烧灼时，但都是根据这三个因素而设计的，干冰，使菌种与空气隔绝。 （4）另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土。　　保藏时间依微生物的种类而有不同、立克次氏体，而后进行干燥的保藏法，细菌最好每月移种一次、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，不需特殊设备、食盐。 （7）需要使用菌种、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用）。 4．寄主保藏法　 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物、硅胶。3．载体保藏法　 是将微生物吸附在适当的载体，-50—-80℃），移至2—8℃的冰箱中保藏，备用，放入液体培养基内。 三、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法，用真空泵抽气至干。保护剂有牛乳。 2．液体石蜡保藏法 （1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内。 （6）将棉花塞入管内、二甲亚砜等，前两者可保藏2年左右。此法较液氮，冰箱、化学特性不是严格恒定的，灭菌滴管、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，在适宜的斜面培养基上培养，酵母菌可保藏1—2年，使其吸饱。 四。霉菌，使得到健壮的菌体或孢子。 　　此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法、操作步骤，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，灭菌脱脂牛乳，1．05kg&#47。 （3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡、放线菌，可将安瓿管口在火焰上烧热，液氮冷冻保藏器，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，在37℃温箱内，所占位置较大，以去掉粗颗粒，121．3℃灭菌30分钟、糖类，取数环菌苔在牛乳内混匀，因为培养基的物理，制成浓悬液，保存于低温下，加热煮沸30分钟，无水氯化钙。酵母菌两个月;，用40目筛子过筛。 （3）烘干，不需要特殊设备、昆虫，如病毒。 5．冷冻保藏法　 可分低温冰箱（-20—-30℃。 3．滤纸保藏法 （1）将滤纸剪成0．5×1．2cm的小条。2．液体石蜡覆盖保藏法　 是传代培养的变相方法。 （2）将需要保存的菌种、滤纸上，应特别注意，用自来水冲洗至中性； 　　肉膏蛋白胨斜面培养基、酵母菌，真空压力表、血清，管形安瓿管，河沙，塞以棉塞。 6．冷冻干燥保藏法　 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，优点是操作简单，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡。 （2）倒去酸水，注入已长好菌的斜面上。 4．沙土保藏法 （1）取河沙加入10％稀盐酸，且不需经常移种，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，有些丝状真菌甚至可保藏14—17年之久，如土壤，真空泵。 　　此法实用而效果好，以去除其中的有机质，化学纯的液体石蜡、冷冻干燥法简便，碾碎，在最适宜的斜面培养基中培养，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害，它们必须在生活的动物，滴一滴冷水在烧热的部位，同时也不便携带，10％盐酸，喷灯，121．3℃灭菌30分钟;，使充分生长。 （2）将需要保藏的菌种、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月；污染杂菌的机会亦较多、螺旋体等、酵母菌。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛，复活培养时，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。 　　细菌，使用方便，在保藏过程中;cm2&gt。从液体石蜡下面取培养物移种后，培养后于4—6℃冰箱内保存，待安瓿管开启后，泪滴形安瓿管（长颈球形底），L形五通管、沙子，甘油，再用镊子敲掉口端的玻璃，屡次传代会使微生物的代谢改变，能随时检查所保藏的菌株是否死亡。 （4）将试管直立，低温冰箱（-30℃）。 　　有些方法如滤纸保藏法，以减弱代谢作用，95％酒精，塞上棉塞，再放回至安瓿管中，使玻璃破裂，用火焰按图Ⅶ-13熔封、器材　　细菌，40目与 100目筛子。 1．斜面低温保藏法　 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上。 （4）用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内、变异与污染杂菌等，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法： 1．传代培养保藏法　 又有斜面培养。 （3）取灭菌脱脂牛乳1—2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，所以，亦可保藏3个月之久，1．05kg&#47，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，待菌充分生长后，每管1—2张。 （5）烘干，并用牛皮纸包扎，菌种保藏方法虽多，放线菌和霉菌，而影响微生物的性状，不需特殊设备，然后放在40℃温箱中、芽孢细菌可保藏2年以上不死，直至中性，塞上棉塞，干燥器，棉塞部分用油纸包扎好、鸡胚内感染并传代。 　　低温，灭菌培养皿，能够适当延长保藏时间，其用量以高出斜面顶端1cm为准（图Ⅶ-12），五氧化二磷，灭菌水，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡、穿刺培养。 保藏方法大致可分为以下几种、丝状真菌均可用此法保藏菌种保藏方法大全
基本原理　　微生物具有容易变异的特性，因此。缺点是保存时必须直立放置，以去除粗颗粒。
生产柠檬酸用的菌种，瘦黄土或红土
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菌种保藏一般是为了保存原始菌以便以后进一步实验或者生产 保藏方法有很多 楼上也讲了 具体看菌种和要求了 柠檬酸发酵的话 你们用的是黑曲霉吗？
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菌种科学保藏常用方法
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生产母种通常用PDA培养基，选用180&18毫米试管，制成斜面试管接种而成。PDA培养基配方：
&土豆（去皮、去芽）
200克（也可用淀粉，用量为6克/1000毫升）
& 葡萄糖 20克
& 琼脂 20克
& 磷酸二氢钾 2克
& 复合维生素B 2克
& 旦白胨 5克
& 硫酸镁 0.3克
& 加水 1300毫升
本刊记者高级农艺师丁湖广
菌种是国家重要的生物资源，是以微生物为对象的研究和生产所必不可少的材料。因此，世界各国对菌种的保藏极为重视，有55个国家专门设菌种保藏机构。国际微生物学会设有世界菌种保藏机构，简称WFCC，编写有《世界菌种保藏名录》。我国菌种保藏机构，有中国微生物菌种保藏管理委员会（设在北京），共保藏有8000多个菌株，其任务是收藏、供应各种优良菌种。
菌种保藏的目的是：使菌种长期保藏之后，仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征，以及不污染杂菌和不发生虫害。菌种保藏的原理是通过低温、干燥、隔绝空气（真空）和断绝营养等手段，以达到最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制菌丝的生长的繁殖。由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，所以能够保藏较长时间。
现将菌种保藏的几种主要方法介绍如下。
一、斜面低温保藏&&&
这是一种常用最简便的保藏方法。首先将需要保藏的菌种移接到PDA培养基上。为了减少培养基水分散发，延长保藏时间，在配制时琼脂用量加到2.5％，再加入0.2％磷酸氢二钾、磷酸二氢钾及碳酸钙等缓冲剂，以中和保藏过程中产生的有机酸。如果是保藏香菇和木耳菌种，应把配方中的葡萄糖换成麦芽糖，培养基装入量不少于12毫升。菌种接种后置于用适宜温度下培养至菌丝长满斜面，然后选择菌丝生长健壮的试管，先用硫酸纸包扎好管口棉塞，再将若干支试管用牛皮纸包好。也可以用无菌胶塞代替棉塞，既能防止污染，又可隔绝氧气，避免斜面干燥。
具体做法是：选择大小合适的橡皮胶塞，洗净晾干，在75％酒精液中消毒1小时后，用无菌纱布吸去酒精，在火焰上方烧去残留的酒精液；于无菌条件下，将试管口在火焰上灼烧灭菌，拔出棉塞，换上胶塞，再用石蜡密封，放入4℃左右的电冰箱内保存。每隔3～4个月转管一次。如果用胶塞石蜡封口，转管期可延迟至6个月。
斜面低温保藏过程，冰箱内相对湿度应控制在40％～50％，尽量少启用冰箱，以免产生冷凝水而引起污染；若必须启用应边开、边取、边关，做到快速、短暂、熟练。对于个别不耐低温的菌种，如草菇菌丝在5℃下易于死亡，一般置10～12℃条件下保藏，或加质量分数0.1无菌甘油作防冻剂，然后置于4～6℃冰箱贮藏。低温贮藏法简单易行，适用于所有食用菌，是最实用贮藏方法，已得广泛应用。在冰箱较普及的情况下，食用菌专业户、菇农等均可采用。缺点是贮藏时间短，需经常继代培养，不但费时费工，而且传代多，易引起污染、衰退或造成差错。
二、液体石蜡保藏&&&
液体石蜡又名矿油，所以该法又称矿油保藏法。这种方法操作简便，只要在菌苔上灌注一层无菌的液体石蜡，即可使菌种与外界空气隔绝，达到防止培养基水分散失，抑制菌丝新陈代谢，推迟菌种老化，延长菌种生命和保存时间的目的。所以此种方法也称为隔绝空气保藏法。
具作：选用化学纯液体石蜡100毫升，装入250毫升锥形瓶内，瓶口加棉塞，置于0.103兆帕（1.055千克/厘米2）灭菌30～60分钟；然后置于160℃烘箱中处理1～2小时；或置40℃温箱内3天左右，见瓶内液体石蜡呈澄清透明，液层中无白色雾状物时即可。其目的是使灭菌时进入瓶内的水分得到蒸发。然后在无菌条件下，将液体石蜡倾注或用无菌吸管移入生长健壮、丰满的斜面菌种上，使液体石蜡高出斜面顶端1厘米左右；最后直立放置在洁净的室温下贮藏，转管时直接用刀切取1小块菌种，移接到新的斜面培养基中央，适温培养，余下的菌种仍在原液体石蜡中贮藏。
因经贮藏后的菌丝沾有石蜡，生长慢而弱，需再继代转接1次方可使用。贮藏场所应干燥，防止棉塞受潮发霉；定期观察，凡斜面暴露出液面，应及时补加液体石蜡。也可用无菌橡皮塞代替棉塞：或将棉塞外露部分用刀片切除，蘸取融化的固体石蜡封口，以减慢蒸发。此法贮藏时间可达1年以上，有的可达10年，效果好。
三、悬液保藏&&&
此法是将需要保种的菇类菌丝球或孢子保藏在适当的媒液中。现介绍3种媒液的保藏方法：
1、生理盐水保藏法：本法适合保藏深层培养的菌丝球，以无菌生理盐水作为媒液进行保藏。首先制备生理盐水，按常规法制备0.85％的生理盐水，健壮试管每管装约5毫升，经高压灭菌。将保藏的菌种接入马铃署、葡萄糖液体培养基中，250毫升三角瓶装入60毫升，振荡培养5～7天（27～28℃，180转/分）。然后吸取菌丝球4～5个放入上述试管中，管中加上无菌橡皮塞，并用固体石蜡封好，置于4℃下保藏。据黑龙江应用微生物研究所报道，用此法保藏香菇、紫芝菌种，可存活18个月：保藏双孢蘑菇、木耳、银耳、金针菇、茯苓、假蜜环菌、金顶磨、糙皮侧耳、猴头菌等菌种、可存活2年。
2、蒸馏水保藏法：这是保存斜面菌种和孢子最简单的方法，有效期可达1年以上。斜面蒸馏水贮藏：在锥形瓶内装入容量1/3左右的蒸馏水，加棉塞，在0.103兆帕（1.055千克/厘米2）121℃灭菌30分钟，冷却。在无菌条件下，将蒸馏水倾注入需保藏的斜面菌种内。加水量需高出斜面顶端1～2厘米，更换无菌橡皮塞，直立置于4～6℃冰箱内贮藏。孢子蒸馏水贮藏：试管内分装入蒸馏水，装量约管长的1/5，加棉塞经灭菌冷却后在无菌条件下提取少许孢子，移入试管蒸馏水内，换上橡皮塞，直立置于4～6℃冰箱内贮藏。上述两种方法，若保存时间较长，中途需补充无菌蒸馏水。使用时从管内挑取菌种块或蘸取孢子悬液，移接至新的斜面培养基上活化培养。原试管加塞后仍可继续贮藏。
3、营养液贮藏：马铃署综合培养基内不加琼脂，并加水稀释10倍，分装入试管内，装量约为管长1/4。棉塞上衬1层低压乙稀薄膜，防止棉塞滋生杂菌。然后经0.103兆帕（1.055千克/厘米2）121℃高压灭菌30分钟，冷却后在无菌条件下，移接入菌丝球或带琼脂的菌丝块，直立置室温8～28℃条件贮藏。以后液面逐渐形成菌苔，并沿管壁蔓延。使用时挑取菌苔或菌丝球、菌块，移接至新的斜面培养基上，适温活化培养。
四、载体保藏&&&
载体保藏是使食用菌孢子吸附在适当的载体上，如砂土、滤纸等进行干燥保藏的一种方法。其原理是利用孢子具有坚厚的细胞壁，对干燥具有较强的抵抗力，在干燥环境中保存若干年后，遇到适宜的条件，仍会萌发生长的特性而进行保藏的。绝大多数孢子都可采取此法保藏。
1、砂土管贮藏：此法具有广泛应用，适于贮藏孢子和酵母状分生孢子，而对菌丝体不适用。操作时选用细河砂，用内径0.250～0.177毫米筛孔过筛,除去粗粒和砂未；另取耕作层以下、瘠薄的红黄壤土，通过内径0.149毫米过筛，砂土中含铁屑，需用磁铁衬纸吸除，并用0.05～0.1盐酸浸泡半天，除去有机质。然后用清水反复冲洗至酸碱度近中性后，置于60～80℃烘箱中烘干。砂土比例2:1或4:1混合，分装入10毫米&100毫米试管或安瓿瓶内，每管装量0.5克，高度约0.7厘米，加棉塞。经0.138兆帕（1.4千克/厘米2）127℃高压灭菌30分钟，每天1次，共3次。也可采用160℃干热灭菌1次，保持2～3小时。灭菌后挑取少许砂土移至PDA斜面上培养，证实无杂菌即可。
砂土管中接入孢子分为干接入和湿接两种。干接时，用接种环直接挑取孢子2～3环，拌入砂土管中：湿接时，将孢子刮入5毫升无菌水的试管内，充分摇匀，制在孢子悬液，然后用1毫升吸管吸取悬液，每管中加入0.2毫升。干接法制成的砂土管，含水分少，可直接放在盛有无水氯化钙、变色硅胶或生石灰的广口瓶内保存：湿接法制成的砂土管，需放入干燥剂的真空干燥器内，用真空泵抽气8～10小时，使之干燥。此工作需在接入孢子后12小时内完成，以免孢子发芽。抽干后砂土需用抽样进行无菌检查，合格者可放在盛有无水氯化钙或变色硅胶的大试管内，加橡皮塞，放置4～6℃冰箱中贮藏。此法保藏孢子，寿命可达2～10年，使用时在无菌条件下，挑取少许砂土孢子，抖撒在PDA斜面上，适温培养，菌丝生长后，再转管培养1次。
2、孢子滤纸保藏：将食用菌孢子吸附在滤纸上，干燥后再行低温保藏。此法操作方便，效果也较理想。适用于蘑菇、金针菇、黑木耳和猴头菌等。用滤纸保藏其孢子，可存活18个月。
具体操作：将白色滤纸或黑色粗而厚纸剪成宽约0.6厘米，长2厘米的滤纸条若干张，平铺在大培养皿底，经0.096兆帕（0.984千克/厘米2）120℃高压灭菌30分钟后，在烘箱中稍加烘干。然后将灭菌的滤纸条培养皿移入孢子采罩内，接受孢子（孢子白色宜用黑色纸）。待孢子弹射滤纸条后，用镊子将纸条移入PDA斜面中，管内先装若干变色硅胶干燥剂。然后置干燥器中1～2天，充分干燥后，用火焰熔封试管口，即制成滤纸条保藏管，贴好标签，置于低温下保藏。需用时先用砂轮在管壁外划痕，再在划痕处稍加热，然后用浸有来苏儿湿布敷上，管壁即自动破裂，此时以无菌操作，镊取滤纸条，将附有孢子的一面贴在培养基上，适温下培养一周左右，孢子即萌发菌丝。
五、天然基质保藏&&&
天然基质的种类很多，下面介绍常见的几种保藏法。
1、麦粒种保藏法：用麦粒来保藏蘑菇和灵芝菌种，保藏期蘑菇达18个月，而灵芝可达5年之久仍有生活力。制作方法如下：选取无病虫害新鲜小麦，淘洗后在水温20℃下浸5小时，使麦粒含水量达25％为宜。将麦粒稍晾干后，装入试管长度的1/3。然后置于0.103兆帕（1.055千克/厘米2）高压灭菌40分钟后，趁热摇散，冷却接种。每管内接入菌丝悬浮液一滴，摇匀后置于25℃室内培养。当大多数麦粒出现菌丝时，移于干燥冷凉的地方保藏。
2、枝条种保藏法：采用树木枝条作为木腐型菇菌的保藏培养基。选取直径1～1.5厘米的阔叶树枝条,截成1.5～2.0厘米长，晒干备用。使用时将枝条在5％米糠水中浸泡12小时，吸足水分。拌好木屑培养基，按枝条与木屑培养基以3:1的体积比混匀；装入大试管或菌种瓶内，并在表面覆盖一薄层木屑培养基，压平；清洗管壁。按常规法进行灭菌接种、培养，待菌丝长好后，置于常温下或冰箱内保藏。
3、木屑种保藏法：配料按78％木屑、20％麸皮、1％蔗糖、1％石膏粉，加适量水拌匀；装入试管长度3/4，洗净管口，塞好棉塞；用牛皮纸包好管口，置于0.103兆帕（1.055千克/厘米）灭菌40分钟；接种后在25℃下恒温培养。待菌丝长到培养基2/3小时取出，用蜡将棉塞封好，包上塑料薄膜，放入4℃冰箱内，能保藏1～2年。使用时从冰箱取出后，置于25℃恒温箱内培养12～24小时。
4、发酵粪草种保藏法：草腐型菇菌以蘑菇发酵粪草料的保藏为例。选取蘑菇栽培用的发酵料，晒干后去除粪块；将料草切成2厘米长，在清水中浸4～5小时，让料草浸透水，并使之失去一部分养分，沥水控湿至含水量68％左右。将处理好的料草装入大试管中，松紧适当，过紧空隙小空气少，菌丝生长慢；过松则菌丝抗逆能力差，影响菌种生活力。装管后清洗管壁，加上棉塞，经0.103兆帕（10.55千克/厘米2）121℃高压力灭菌2小时，冷却后接种，置于25℃条件下培养，待菌丝长满管后，用石蜡将棉塞封闭，或更换无菌橡皮塞，置电冰箱内保藏。（草菇不耐温，不可置于冰箱内可藏）
六、真空干燥保藏&&&
采用低温、干燥和真空办法，使菌种的新陈代谢活动处于高度静止状态，也就是在极低温度下（-70℃左右）快速冷冻，然后在极低温度下真空干燥，使菌体细胞结构成分保持原来状态。因此，菌种保藏10～20年，仍不降低其原有性能。冷冻干燥是目前应用最广泛、效果较好的一种菌种保藏方法。具体操作方法：
1、安瓿瓶的准备：取中性玻璃安瓿瓶，规格内径8毫米、长度不小于100毫米的为好。先用2％盐酸浸泡12小时，再用清水洗涤3次，然后用蒸馏水洗净、烤干；瓶口加棉塞，灭菌后备用。
2、保护剂的选择：保护剂的作用是使细胞在冻干过程中免受损伤及减少在保藏过程中的死亡。保护剂种类很多，如牛马血清、无菌牛奶等，多数菌种保藏是脱脂牛奶。脱脂牛奶的制备方法是：先将牛奶放在阿诺氏灭菌器内加热30分钟，再置于冰箱内，待油脂上浮后用吸管吸取底层牛奶。然后经0.73兆帕压力灭菌15分钟备用。
3、冷冻干燥装置：一般条件好的实验室备有5PS快速真空离心冷冻干燥机。这个装置包括1台真空泵、1付麦氏真空计、1个缓冲瓶、1个真空干燥器（内装五氧化二磷或无水氯化钙等干燥剂）和1个冷冻槽（内盛有1:3的食盐和碎冰块）。
4、制备孢子液：按无菌操作法收集菇菌孢子，用接种针挑取孢子接入盛有2～3毫升无菌脱脂牛奶的试管中，稍加搅动即制成悬浮液。用吸管吸取悬浮液注入安瓿瓶。每管分装约0.2毫升，注意不要溅污上部管壁，防止杂菌污染和熔封时引起碳化。分装应在1小时内完成，装后棉花塞好管口。
5、预冻孢子液：在冷冻干燥之前，先将孢子液的安瓿瓶，置于低温冰箱中预冻1小时，其目的是防止抽气初期产生大量泡沫而外溢。也可将安瓿瓶置于1:1的干冰（固态二氧化碳）和95％乙醇或丙酮液中低温预冻。安瓿瓶放在上述冻结剂中，只需4～5分钟，温度便可达-70℃。
6、减压干燥：将预冻时附在这瓿瓶管上的冰水揩干，立即放入干燥器中抽真空。真空度用“麦氏真空计”测量，一般掌握在30分钟内能达到93.3帕时，菌种冻块才不致融化，继续抽气到真空26.6帕后，保持6～8小时即可。
7、真空熔封：菌种安瓿瓶经减压干燥后，应立即取出安装在封口用的玻璃抽气管上，进行抽气熔封管口。抽气管是一个多歧管，每个分支管口接有真空橡皮管，安瓿瓶口就插在橡皮管内。熔封须保持在真空状态下抽气约10分钟即可达26.6帕。边抽气，边用煤气或酒精灯的细火焰，对准安瓿瓶中央，即可熔断封口。熔封时应注意火焰，不宜过大。
安瓿瓶菌种启用时，在无菌操作下打开这瓿瓶，加入0.3～0.5毫升的无菌生理盐水或1％麦芽汁即可使用。
由于真空干燥保藏的菌种是密封在安瓿瓶里的，因此不仅邮寄运输方便，并且不会污染杂菌。此法适于能形成孢子的菇类长期保藏，其设备和操作均较复杂。
七、液态氮超低温保藏&
将要保藏菌种的悬浮液或菌块，密封于盛有保护剂的安瓿瓶里，先在控制的条件下致冷，使之缓速预冻，再置于-150至-196℃液态氮超低温冰箱中保藏。其原理是：采用超低温手段，使菌体细胞代谢活动降低到最低水平，甚至处于休眠状态。它的优点是：保存时间可长达数年至数十年；适用范围广，对一些即使不耐低温菌种，如草菇等，也可在保护剂的保护下进行超低温保存；此外，经保藏的菌种基本上不发生变异。
培养基常用马铃薯汁1000毫，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，PH5.6。冷冻保护剂可用10％（V:V）的甘油蒸馏水或10％（V:V）的二甲亚砜蒸馏水。按无菌操作法收集孢子，制成孢子悬浮液。将上述培养基经灭菌后，趁热倒入无菌培养皿制成平板，在中心点接入欲保存的菌种，适温培养。
安瓿瓶的玻璃应能经受温度的突变而不破裂，并容易熔封管口。瓶的大小为75&10毫米，能容1.2毫升保护剂。每瓶装入0.8毫升的保护剂，加上棉塞，经0.096兆帕（0.984千克/厘米2）压力灭菌15分钟即可。若直接用无菌保护剂制备菌悬液，则可将安瓿瓶空管灭菌，然后按无菌操作法将菌悬液或菌丝片装入安瓿瓶内，经火焰熔封瓶口后，可用浸水法检查是否漏气。将封口的安瓿瓶放在慢速冷冻器内，以每分钟下降1℃的速度缓慢降温，使样品冻结到--35℃，达—35℃以下后，其冻结速度则不需控制。当瓶内的保护剂和菌丝块冻结后，即可将安瓿瓶置于液氮冰箱里保藏。
使用时，取出安瓿瓶，立即置38～40℃的水浴中，使瓶内的冰块迅速融化；然后打开安瓿瓶，取出接种物，移至适宜的培养基上培养；同时应有防护措施，如套戴皮或棉手套等，防止液态氮气溅而冻伤皮肤。
五、天然基质保藏&&&&
天然基质的种类很多，下面介绍常见的几种保藏法。
1、麦粒种保藏法：用麦粒来保藏蘑菇和灵芝菌种，保藏期蘑菇达18个月，而灵芝可达5年之久仍有生活力。制作方法如下：选取无病虫害新鲜小麦，淘洗后在水温20℃下浸5小时，使麦粒含水量达25％为宜。将麦粒稍晾干后，装入试管长度的1/3。然后置于0.103兆帕（1.055千克/厘米2）高压灭菌40分钟后，趁热摇散，冷却接种。每管内接入菌丝悬浮液一滴，摇匀后置于25℃室内培养。当大多数麦粒出现菌丝时，移于干燥冷凉的地方保藏。
2、枝条种保藏法：采用树木枝条作为木腐型菇菌的保藏培养基。选取直径1～1.5厘米的阔叶树枝条,截成1.5～2.0厘米长，晒干备用。使用时将枝条在5％米糠水中浸泡12小时，吸足水分。拌好木屑培养基，按枝条与木屑培养基以3:1的体积比混匀；装入大试管或菌种瓶内，并在表面覆盖一薄层木屑培养基，压平；清洗管壁。按常规法进行灭菌接种、培养，待菌丝长好后，置于常温下或冰箱内保藏。
3、木屑种保藏法：配料按78％木屑、20％麸皮、1％蔗糖、1％石膏粉，加适量水拌匀；装入试管长度3/4，洗净管口，塞好棉塞；用牛皮纸包好管口，置于0.103兆帕（1.055千克/厘米）灭菌40分钟；接种后在25℃下恒温培养。待菌丝长到培养基2/3小时取出，用蜡将棉塞封好，包上塑料薄膜，放入4℃冰箱内，能保藏1～2年。使用时从冰箱取出后，置于25℃恒温箱内培养12～24小时。
4、发酵粪草种保藏法：草腐型菇菌以蘑菇发酵粪草料的保藏为例。选取蘑菇栽培用的发酵料，晒干后去除粪块；将料草切成2厘米长，在清水中浸4～5小时，让料草浸透水，并使之失去一部分养分，沥水控湿至含水量68％左右。将处理好的料草装入大试管中，松紧适当，过紧空隙小空气少，菌丝生长慢；过松则菌丝抗逆能力差，影响菌种生活力。装管后清洗管壁，加上棉塞，经0.103兆帕（10.55千克/厘米2）121℃高压力灭菌2小时，冷却后接种，置于25℃条件下培养，待菌丝长满管后，用石蜡将棉塞封闭，或更换无菌橡皮塞，置电冰箱内保藏。（草菇不耐温，不可置于冰箱内可藏）
六、真空干燥保藏&&&
采用低温、干燥和真空办法，使菌种的新陈代谢活动处于高度静止状态，也就是在极低温度下（-70℃左右）快速冷冻，然后在极低温度下真空干燥，使菌体细胞结构成分保持原来状态。因此，菌种保藏10～20年，仍不降低其原有性能。冷冻干燥是目前应用最广泛、效果较好的一种菌种保藏方法。具体操作方法：
1、安瓿瓶的准备：取中性玻璃安瓿瓶，规格内径8毫米、长度不小于100毫米的为好。先用2％盐酸浸泡12小时，再用清水洗涤3次，然后用蒸馏水洗净、烤干；瓶口加棉塞，灭菌后备用。
2、保护剂的选择：保护剂的作用是使细胞在冻干过程中免受损伤及减少在保藏过程中的死亡。保护剂种类很多，如牛马血清、无菌牛奶等，多数菌种保藏是脱脂牛奶。脱脂牛奶的制备方法是：先将牛奶放在阿诺氏灭菌器内加热30分钟，再置于冰箱内，待油脂上浮后用吸管吸取底层牛奶。然后经0.73兆帕压力灭菌15分钟备用。
3、冷冻干燥装置：一般条件好的实验室备有5PS快速真空离心冷冻干燥机。这个装置包括1台真空泵、1付麦氏真空计、1个缓冲瓶、1个真空干燥器（内装五氧化二磷或无水氯化钙等干燥剂）和1个冷冻槽（内盛有1:3的食盐和碎冰块）。
4、制备孢子液：按无菌操作法收集菇菌孢子，用接种针挑取孢子接入盛有2～3毫升无菌脱脂牛奶的试管中，稍加搅动即制成悬浮液。用吸管吸取悬浮液注入安瓿瓶。每管分装约0.2毫升，注意不要溅污上部管壁，防止杂菌污染和熔封时引起碳化。分装应在1小时内完成，装后棉花塞好管口。
5、预冻孢子液：在冷冻干燥之前，先将孢子液的安瓿瓶，置于低温冰箱中预冻1小时，其目的是防止抽气初期产生大量泡沫而外溢。也可将安瓿瓶置于1:1的干冰（固态二氧化碳）和95％乙醇或丙酮液中低温预冻。安瓿瓶放在上述冻结剂中，只需4～5分钟，温度便可达-70℃。
6、减压干燥：将预冻时附在这瓿瓶管上的冰水揩干，立即放入干燥器中抽真空。真空度用“麦氏真空计”测量，一般掌握在30分钟内能达到93.3帕时，菌种冻块才不致融化，继续抽气到真空26.6帕后，保持6～8小时即可。
7、真空熔封：菌种安瓿瓶经减压干燥后，应立即取出安装在封口用的玻璃抽气管上，进行抽气熔封管口。抽气管是一个多歧管，每个分支管口接有真空橡皮管，安瓿瓶口就插在橡皮管内。熔封须保持在真空状态下抽气约10分钟即可达26.6帕。边抽气，边用煤气或酒精灯的细火焰，对准安瓿瓶中央，即可熔断封口。熔封时应注意火焰，不宜过大。
安瓿瓶菌种启用时，在无菌操作下打开这瓿瓶，加入0.3～0.5毫升的无菌生理盐水或1％麦芽汁即可使用。
由于真空干燥保藏的菌种是密封在安瓿瓶里的，因此不仅邮寄运输方便，并且不会污染杂菌。此法适于能形成孢子的菇类长期保藏，其设备和操作均较复杂。
七、液态氮超低温保藏&
将要保藏菌种的悬浮液或菌块，密封于盛有保护剂的安瓿瓶里，先在控制的条件下致冷，使之缓速预冻，再置于-150至-196℃液态氮超低温冰箱中保藏。其原理是：采用超低温手段，使菌体细胞代谢活动降低到最低水平，甚至处于休眠状态。它的优点是：保存时间可长达数年至数十年；适用范围广，对一些即使不耐低温菌种，如草菇等，也可在保护剂的保护下进行超低温保存；此外，经保藏的菌种基本上不发生变异。
培养基常用马铃薯汁1000毫，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，PH5.6。冷冻保护剂可用10％（V:V）的甘油蒸馏水或10％（V:V）的二甲亚砜蒸馏水。按无菌操作法收集孢子，制成孢子悬浮液。将上述培养基经灭菌后，趁热倒入无菌培养皿制成平板，在中心点接入欲保存的菌种，适温培养。
安瓿瓶的玻璃应能经受温度的突变而不破裂，并容易熔封管口。瓶的大小为75&10毫米，能容1.2毫升保护剂。每瓶装入0.8毫升的保护剂，加上棉塞，经0.096兆帕（0.984千克/厘米2）压力灭菌15分钟即可。若直接用无菌保护剂制备菌悬液，则可将安瓿瓶空管灭菌，然后按无菌操作法将菌悬液或菌丝片装入安瓿瓶内，经火焰熔封瓶口后，可用浸水法检查是否漏气。将封口的安瓿瓶放在慢速冷冻器内，以每分钟下降1℃的速度缓慢降温，使样品冻结到--35℃，达—35℃以下后，其冻结速度则不需控制。当瓶内的保护剂和菌丝块冻结后，即可将安瓿瓶置于液氮冰箱里保藏。
使用时，取出安瓿瓶，立即置38～40℃的水浴中，使瓶内的冰块迅速融化；然后打开安瓿瓶，取出接种物，移至适宜的培养基上培养；同时应有防护措施，如套戴皮或棉手套等，防止液态氮气溅而冻伤皮肤。
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第六节　　菌种保藏
　　蘑菇菌种和其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性。遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此，而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困难。由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产质量降低等现象，菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌和发生虫害。能够长期在生产上和研究上应用。
　　微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微生物代谢活力旺盛，它的变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态，以减少变异的发生。菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达到最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制菌丝的生长和繁殖。由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。
二、保藏方法
（一）斜面冰箱保藏法
　　这是蘑菇菌种的一种短期保存法，因为它简单易行，不需特殊设备，并能随时观察保藏菌种的情况，因此也是常用的菌种保藏方法。
１、保藏方法　蘑菇菌种斜面冰箱保种一般使用PDA斜面培养基即可。菌种移接后，放在22-24℃温度下培养,要勤检查,当菌丝健壮地长满试管时,及时挑选无污染的培养斜面,棉塞用硫酸纸包扎后放置在4℃的冰箱中保藏。一般2-3个月转管一次。
２、注意事项：由于斜面冰箱保藏是在4℃下进行,微生物单孢分离物活动并未停止,需要经常转管移接,因此对于保藏所用的斜面菌种质量要求较高，其菌丝形态、菌落特征应保持原有特性，操作人员必须对斜面菌种质量应具有有一定的鉴别能力，所挑选的菌种才能适合保藏，其次菌种的菌龄不能太幼也不能太老，否则冰箱保藏后转管扩接易造成退化。再则冰箱温度应控制在2-4℃之间,尽量恒温使菌丝体处于稳定的生理状态。
（二）粪草管冰箱保藏法
１、保藏方法：粪草管的培养基是由腐熟麦秆粉100,腐熟牛粪粉25,麸皮8,
石膏粉1%,碳酸钙2%,含水量65%左右,pH7.5制备而成,调配后装入试管中,经高压灭菌后,接入菌种块,放在22-24℃温度下培养。要勤检查是否有污染，当菌丝健壮地长满草基试管时，及时挑选生长正常无污染的试管，棉塞头用硫酸纸包扎后放置在2-4
℃的冰箱中,该保藏方法为中期保藏，一般2-3年转管一次。
２、注意事项：由于粪草管可保藏2-3年时间,因此如何防止粪草管的水分损失是该保藏方法时间长短的关键所在,一方面培养基含水量不能低于62%,
另一方面棉塞用硫酸纸包扎后可加些蜡进行封口,防止水分蒸发。再则有条件应把试管保藏在具有保湿的冰柜或冰库中，温度控制在2-4℃,湿度控制在90%左右。
（三）液体石蜡保藏方法
　　液体石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与　空气接触，抑制菌丝的单孢分离物，可能使其处于休眠状态，推迟细胞衰老，延长菌丝的保藏，一般可保藏5-7年，是一种中长期的菌种保藏方法。
１、保藏方法：液蜡保藏蘑菇菌种的培养基为PDA斜面即可。将菌种块移接到PDA斜面上,在22-24℃下培养15-20天,然后用液体石蜡封藏保存。液体石蜡要选化学纯的，在121℃下高压灭菌30分钟,再将液体石蜡在160℃烘箱中加热1-2小时。亦可将高压灭菌后的液体石蜡放置在40-60℃温箱中,使灭菌后的液体石蜡层出现乳白色直至变成完全透明的无色为止,目的是将高压灭菌时侵入液体石蜡中的水蒸发干净。将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1.0厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，置室温中保藏。
２、注意事项：菌丝的培养时间不能太短，为防止菌丝体的进一步发育，可适当延长菌龄或让试管先置在冰箱中(2-4℃)2天后再加入液体石蜡。倒入的液体石蜡要超过斜面尖端1.0厘米左右,如过低液体石蜡挥发后会露出斜面,
从而导致斜面培养基的干涸,缩短了保藏时间。烘烤液体石蜡应乇底，尽可能把水分蒸发干净，防止水蒸汽蒸发导致棉花塞潮湿长霉而影响菌种的保藏。
（四）滤纸保藏法
　　将蘑菇孢子吸附在滤纸条上，干燥后放入冰箱进行保藏，由于该保藏是有性的孢子，一般不用于生产中，主要是起到保藏种质资源的作用及菌种的选育，根据福建省蘑菇菌种研究推广站的滤纸孢子保藏试验，用该方法已保藏蘑菇菌种达10年以上,孢子成活率约为50-80%之间。
１、保藏方法：孢子收集方法同单孢子分离的孢子收集，当滤纸条上收到有相当数量孢子后，用无菌镊子将滤纸条无菌操作放入无菌试管中，将该试管放在抽真空的干燥器中1-2天,除去滤纸条上水分使之充分干燥,随后把试管口封好,粘好标签,
放在冰箱中保藏。
（五）真空冷冻干燥保藏法
　　真空冷冻干燥简称冻干。这种方法是利用低温使孢子先冷冻，然后再在真空条件下，使孢子中的水分升华排出，孢子处于休眠状态，但仍保持原有活力，是一种长期保藏蘑菇孢子的保藏方法，具体操作如下。
（１）选用内径8mm,长120mm的中性玻璃管作为制安瓿管的材料。将玻管用2%
盐酸浸泡8-10小时,再用蒸馏水洗2-3次后,置烘箱中烘干。将印有菌号、编号、制作日期的标签放入安瓿管中，塞好棉塞，进行干热灭菌。
（２）用接种铲将收集的蘑菇孢子铲入盛有3ml无菌脱脂牛奶的试管中,稍加摇动,
制成孢子悬浮液。用无菌吸管将孢子悬浮液移入安瓿管的球形部分，每管约0.2ml,然后将管口通过火焰,用无菌镊子取少许无菌棉花塞于安瓿管口。
（３）将安瓿管放入无水乙醇与干冰混合的冻装置，温度可达-65～-70℃预冻5
分钟左右,也可在低温冰箱(-40)预冻30-60分钟。然后取出放入真空干燥器中，用高真空活塞油封好立即抽真空，并随时用真空火花检漏仪检查真空度，发现有微小漏气处，要迅速用真空泥涂住。一般真空度应维持在10.7千帕以下,如抽真空10
分钟后仍达不到此真空度,说明真空系统不佳,可能会造成融化而失败。真空干燥器外面用1:3的盐冰水保温,其效果会好些,真空度稳定,一般抽7-8小时,可完全将安瓿瓶中水升华至干。此时应关闭缓冲瓶前的三道阀门，然后再断电。抽干后的安瓿瓶颜色应是白色，如果浅黄色或不成凹状，多数都因为真空度达不到要求而造成融化失败的结果。
（４）冻干好的安瓿瓶要进行真空熔封。可用一个顶端多歧管或一个Ｚ型管，每个分支口都接入真空橡皮管以便将安瓿管接在橡皮管内，然后抽真空，边抽真空边用煤气喷灯熔封。熔封的安瓿　瓶要进行检漏，可用高真空火花检漏仪检查。安瓿瓶内呈蓝色荧光，说明真空封口良好，也可用微带红或蓝的清水浸泡安瓿瓶，经一昼夜安瓿瓶内无颜色水浸入，则为封口合格。
（５）菌种安瓿瓶经无菌检查和存活率检查合格后，置2-8℃冰箱内保藏,一般蘑菇菌种可保藏8-10年。
（６）复苏培养时，可在开启的安瓿管内注入0.3-0.5ml的无菌生理盐水或1%
麦芽汁。菌种安瓿瓶开启时，应先将安瓿瓶的封端加热，在浸有来苏尔等消毒液的湿布上擦一下，使管壁形成裂缝，然后再轻轻敲碎。切忌猛烈割断，以免空气骤然冲入，导致污染。安瓿瓶加入生理盐水后菌种即自行溶化，摇动后即成孢子悬浮液，可接入PDA培养基上,进行萌发培养。
（六）液氮超低温保藏法
　　液氮超低温保种是把菌种装在含有冷冻保护剂的安瓿瓶内，将该安瓿瓶放入液氮(-196℃)中进行保藏,由于菌丝体处于-196℃,其代谢降低到完全停止的状态。所以不需定期移植。从理论上讲，菌丝体可以无限期地存活。蘑菇菌种的液氮保种从1970年开始进行试验,至今已有20多年的历史,经过大量的试验证明液氮保种是菌种长期保藏的最有效最可靠的方法。随着方法的不断改良，现人介绍近年来应用的一种最简便的液氮保种方法。
（１）菌种制备　菌种在PDA培养基平板上于22-24℃下培养10-15天,菌丝体充分生长后,用打孔器(直径2-4mm)打成小孔,或用接种针把菌丝培养物切成2&4mm
长方形小块。
（２）安瓿管的制备　把直径4-6mm
的聚乙烯塑料管（也可用饮料吸管）截成小段做成安瓿管。每节大约60mm长,一头用热合机封好。然后用牛皮纸包装进行121℃下高压灭菌30分钟。
（３）保护剂　10%的甘油水溶液进行121℃下高压灭菌30分钟可作为冷冻保护剂。用量为每安瓿上留有5-10mm的空间,用无菌注射器从管底注入,以防产生气泡。随后，且无菌接种针从安瓿管口放入5-8块菌种块，热合封好安瓿。用记号笔在发瓿管外写上标签，最后在桌　上用一定的力按　压，以检查安瓿是否渗漏。
（４）液氮保藏　把已做好的安瓿菌种管放入具有孔洞的小塑料瓶中（在塑料瓶的底部放一块铁片，使塑料瓶连同安瓿管能一起沉入液氮罐中），盖好瓶盖，在瓶盖上连接一条细绳并作记号，以便提出所需的菌种。把装有安瓿管的塑料瓶吊在液氮罐口上，使安瓿管缓慢地降温，大约30分钟后,把按瓿管浸入液氮中进行长期保存。
（５）恢复培养　如果拟取用液氮保存的菌种，可将安瓿管取出后立即放入35-40℃的温水中迅速解冻,为了防止污染,用75%酒精洗安瓿管表面,表面干燥后,
用火焰烧过的剪刀在安瓿的一端剪开,用无菌接种针把菌块移接至PDA培养基上,置22-24℃培养。
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