杜仲内生真菌的分离与拮抗菌株的筛选--《河南大学》2015年硕士论文
杜仲内生真菌的分离与拮抗菌株的筛选
【摘要】：杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)为杜仲科杜仲属落叶乔木,中国特有经济树种,国家二级保护植物。其次生代谢产物如绿原酸、桃叶珊瑚甙、京尼平甙等具有抗菌、抗肿瘤等药理活性。植物内生菌普遍存在于各种植物中,许多内生菌能产生与宿主植物相同或相似的代谢产物,且许多是未发现过的新物质。利用内生菌筛选生物活性成分或先导化合物成为寻找天然药物的又一条重要途径,并且许多化合物对动植物致病菌有明显的抑制作用,因此在医药领域和农药领域,植物内生菌是目前研究的热点。同一种植物生长在不同的环境,其内生菌的多样性及生物活性都有所不同。目前,杜仲内生真菌研究主要集中于陕西、四川、上海等地,更重要的是缺乏对分离内生真菌活性成分的研究。河南省开封市紧临黄河,位于华中与华北地区分界点,其独特的地理位置及气候条件为研究筛选植物内生菌提供了独一无二的天然资源。本研究采用组织分离法从生长于河南大学药用植物园的杜仲叶和果实分离内生真菌,通过观察菌落性状、大小、颜色筛选。培养液用高效液相色谱法(HPLC)检测培养液中是否含有绿原酸、桃叶珊瑚苷等杜仲的主要活性成分。对峙培养评价每个菌株的抗菌活性。对于对峙法有抗菌活性的菌株,用生长速率法评价抗菌活性。对于抑菌效果好的内生真菌,测定ITS片段,Blast比对鉴定其种类。希望能从中分离到具有良好抑菌效果的内生真菌,为进一步提取优良生物活性和新颖化学结构的内生真菌代谢产物打下基础。结果如下:1.菌种分离用1/4划线法对长出的杜仲内生菌进行分离纯化,用形态观察法和显微检测法对杜仲内生菌菌丝和孢子进行检测分类,结果显示:一共分出91株形态不同的菌株。2.杜仲内生菌次级代谢产物化学成分测定7个菌株能够产生桃叶珊瑚苷;2个菌株能够产生绿原酸;没有菌株能够产生黄酮。3.杜仲内生菌抑菌实验分别采用对峙法和菌丝生长速率法对杜仲内生菌进行抑菌活性的检测,供试菌禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis),小麦根腐(Drechslera Sofokiniana),小麦赤霉病禾谷镰孢(Fusarium graminearum),蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus);人类致病菌有:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),白色念珠菌(Monilia albican),猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis),大肠杆菌(Escherichia coli)。由抑菌实验结果可以看出分离出的菌株中对植物源的供试菌具有抑制作用的菌株较多,且对植物源供试菌具有较好的抑制作用;对动物源的供试菌具有抑制作用的菌株较少,且对动物源供试菌抑制作用较差。4.分子鉴定:用试剂盒提取杜仲内生菌DNA,进行PCR扩增,生物公司测序后,序列在Gene Bank上进行blast比对,对内生菌进行分子学鉴定,鉴定结果显示:1、2、7、9、11、16、18、23、26、27、29、30、42、46号菌株同属于链格孢属(Alternaria);41号菌株属于茎点霉属(Phoma);4号菌株属于黑孢属(Niqrospora);31、49号菌同属于枝孢属(Cladosporium)。
【关键词】：
【学位授予单位】：河南大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：S567.19;S182【目录】：
摘要4-6ABSTRACT6-9第一章 文献综述9-15 第一节 杜仲资源基础研究概论9-13
1 历代杜仲的利用范围9
2 现代对杜仲的利用范围9-10
3 杜仲的药理活性10-12
4 杜仲次生代谢产物的主要类型12-13 第二节 杜仲内生菌研究概论13-15第二章 杜仲内生菌的分离、纯化、菌种保藏以及菌种鉴定15-39 1 试剂与仪器15-16 2 试验方法16-19
2.1 杜仲内生真菌的分离与纯化16-17
2.2 拮抗菌株的筛选17
2.3 活性成分检测17-18
2.4 菌种鉴定18-19 3 实验结果19-34 4 讨论34-37 5 小结37-39参考文献39-43致谢43-44
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京公网安备75号拮抗性山药内生菌的分离和筛选；赵龙飞；（商丘师范学院生命科学学院，河南；商丘476000）；摘要:通过研磨法和涂布平板法对山药（Diosco；关键词:山药（DioscoreabatatasD；中图分类号：S432.4+2文献标识码：A文章编；（Bacillussubtilis)具有明显的抑；IsolationandScreeningofE；fromChine
拮抗性山药内生菌的分离和筛选
（商丘师范学院生命科学学院，河南
商丘476000）
摘要:通过研磨法和涂布平板法对山药（DioscoreabatatasDecne)不同部位的内生菌进行分离，共获得34株菌株，并对这些菌株作拮抗性筛选和生物学特性分析。结果表明，有4株菌株对枯草芽孢杆菌52%；有1株菌株对大肠杆菌（Escherichiacoli)有抑菌效果。对筛选出的4株菌株做了革兰氏染色和芽孢染色、菌体大小和生长曲线等特性分析，表明HNSQSY04的特征符合芽孢杆菌属，HNSQSY14、HNSQSY24和HNSQSY31均有杆菌的特征。
关键词:山药（DioscoreabatatasDecne)；内生菌；抑菌活性；分离；筛选
中图分类号：S432.4+2文献标识码：A文章编号：（8-04
（Bacillussubtilis)具有明显的抑菌效果，抑制率均在24%以上，其中菌株HNSQSY04的抑制率最大，达
IsolationandScreeningofEndophyteswithInhibitionActivity
fromChineseYamRhizomes
ZHAOLong-fei
(CollegeofLifeSciences,ShangqiuNormalUniversity,Shangqiu476000,China)
Abstract:Atotalof34endophyteswereisolatedfromdifferentpartsofChineseyamrhizomesbygrindingmethodandspread
platemethod.Inhibitionactivityagainstpathogensanditsbiologicalcharacteristicswereanalyzed.Theresultsshowedthatfour
strainspreliminarilyscreenedhadobviousinhibitiontoBacillussubtilis,withinhibitionratesofabove24%.StrainHNSQSY04
growthcurveoffourstrainsscreenedwereanalyzed.ResultsshowedthatHNSQSY14，HNSQSY24，andHNSQSY31hadBacillusgenusfeatures.HNSQSY04hadthefeaturesofthegenusGracilibacillus.Keywords:yamrhizome；endophyte；inhibitionactivity；isolation；screening
hadthemaximuminhibitionrateof52%.OnestrainhadinhibitionactivitytoEscherichiacoli.Gramstaining,sporestaining,
植物内生菌（Endophyte）是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物各种组织内部或细胞间隙，而不使宿主产生明显病理症状的微生物[1]。植物是内生菌的宿主并给内生菌提供营养，内生菌则产生具有一定生物活性的次生代谢产物，如植物生长调节剂、抑菌剂、杀虫物质、抗病毒成分等[2]，与植生态环境的作用[3]。将植物内生菌作为生物防治菌
植物薯蓣的块根，是中国传统的药食同源植物。它含有丰富的DHEA、蛋白质、糖类、黏液质、皂苷、维生素、胆碱、淀粉酶、糖蛋白、氨基酸、多酚氧化酶等
山药（DioscoreabatatasDecne）为薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属（Dioscorea）多年生草质藤本
物形成共生互利关系，产生一定的生物防治和稳定
成分。一些研究对山药的内生细菌和真菌进行了分离和筛选[2，6-8]，但鲜见对河南山药病原菌拮抗性内生菌系统研究的报道。本研究以河南山药为试验材料，筛选对细菌具拮抗作用的内生菌，并进行微生
不仅可避免因使用化学农药给环境带来的污染，还可避免杀死非靶标微生物和破坏植物根际土壤的微生态平衡，在防治植物病害方面有较大的应用潜力，成为国内外微生物研究的热点之一[3-5]。
收稿日期：
物学鉴定，以获取其基本信息，为山药拮抗菌的利用提供理论依据。
基金项目：国家自然科学基金项目（）;河南省高校青年骨干教师资助项目（2012GGJS166）；河南省科技厅科技攻关项目作者简介:赵龙飞（1978-），男，河南杞县人，副教授，博士，主要从事植物内生菌资源与应用研究，（电话）（电子信箱）
（）；河南省教育厅科学技术研究重点项目（12A210019）
第10期赵龙飞：拮抗性山药内生菌的分离和筛选2319
1材料与方法
1.11.1.1材料惠店集乡楼村山药
惠楼山药（砂壤土）；，来自于河南省商丘市虞城
铁棍山药，来自河南省焦1.1.2作市温县试剂（黏土草酸铵结晶紫）。
氯酸钠、、卢戈氏碘液、番红、次51.1.3
无水乙醇、孔雀石绿等。
7.2~7.4，121g，蛋白胨LB固体培养基：NaCl10g，酵母膏
牛肉膏蛋白胨液体培养基℃10灭菌g，琼脂20min10[9]g，。液体培养基不加琼脂补水至1000mL，pH：牛肉膏3.0g，蛋白。胨10.0g，NaCl5.0g，补水至1000mL，pH7.2~7.4，121℃
灭菌20min[9]NaCl高氏1号培养基。固体培养基另加琼脂：可溶性淀粉2010g，KNOg。
7.4~7.6，121FeSO4?0.57Hg，K22O℃0.01HPO灭菌g，4?
30琼脂3H2Omin200.5[9]g，g，补水至MgSO4?17H0002OmL，pH
0.5g，1.2。部1.2.1方法
、上部材料的表面消毒，先用无菌水冲洗2~3分别取山药的底部次；把山药放入75%
乙醇中8各部位的水用移液枪分别吸取min，然后用无菌水冲洗30s，迅速取出再放入5~8次5%500。的次氯酸钠中最后一次冲洗过3~μL涂平板，检1.2.2测表面消毒是否彻底。
山药组织内生菌的分离2g放入无菌研钵中、纯化和保藏，研磨至黏稠浆状经表面消毒的[6]向研钵中加入18mL无菌水，搅拌均匀，即制成10，-1的菌悬液10。取不同部位的山药研磨液，分别稀释成-2液的稀释液、10-3、10-45003个梯度μL涂布平板。分别取山药不同部位研磨，3个重复。置入恒温
恒湿培养箱中30℃倒置培养，观察、记录结果。挑取单菌落，以划线分离法接种到培养基上28℃倒置培养1.2.3
24h后镜检观察。重复操作，直至获得纯菌株。
CGMCC1.1103）、1）拮抗菌的筛选和鉴定
病原菌的活化CGMCC1.769），枯草。芽大肠杆菌孢杆菌（（BacillusEscherichiasubtilis
coli物学教研室保藏为商丘师范学院生命科学学院微生。
将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌以平板划线法转接到牛肉膏蛋白胨培养基上，置于培养箱中28℃倒置培养，活化后分别转接到牛肉膏蛋白胨斜面上，待斜面长饱满后暂时保藏于2）拮抗菌筛选。采用滤纸片法4℃冰箱备用。
[10]筛选对病原菌有抑制作用的内生菌。制备大肠杆菌菌悬液，用移液枪吸取200μL涂布牛肉膏蛋白胨平板。在平板上
均匀放置4个直径1.00cm的圆形滤纸片，在滤纸片上加10μL内生菌悬液，以滴加10μL无菌水的作为空白对照，30℃恒温倒置培养。枯草芽孢杆菌的操作方法同大肠杆菌。观察并记录试验结果，选取具有抑菌效果的菌株复筛。复筛以相同方法进行3个重复，培养72h后测抑菌圈直径（含滤纸片），每株菌率衡量3）抑菌效果的计算。
，抑制率=（处理抑菌圈直径。病原细菌抑菌效果用抑制
-滤纸片直径）/滤纸片直径内生菌分别进行革兰氏染色4）拮抗菌株形态学鉴定×100%[11]。
。、参照参考文献芽孢染色、菌体形态[9]，对和大小等的测定。
种到灭菌的5）拮抗菌的生长特征℃波长为130r/minLB600nm培养液体培养基中。把筛选出的内生细菌接处测光密度，每隔2h取样一次，恒温振荡培养箱28。以光密度值，持续（OD44h。在纵坐标、对应的培养时间（h）为横坐标绘制生长曲600nm）为
2结果与分析
2.1内生菌的分离情况
铁棍山药和惠楼山药的不同部位共分离34株菌株，根据菌落特征初步判断其32株为细菌，2株为放线菌。
2.2拮抗菌的筛选和鉴定情况
对山药中分离的34株菌株进行抑菌筛选试验（图1、图2），筛选出4株拮抗菌株，其抑菌情况见表1。
图1初筛（HNSQSY04
24、HNSQSY31从表1可见，HNSQSY04、HNSQSY14、HNSQSY在52%。24%以上，对枯草杆菌都有抑制作用其中HNSQSY04的抑制率最大，抑制率均
，达果不明显HNSQSY31，抑制率仅为对大肠杆菌表现出抑制作用且效12%，其他3株对大肠杆菌
湖北农业科学
表14株内生菌的抑菌效果
菌株HNSQSY14HNSQSY24枯草芽孢杆菌抑菌圈直径//cm抑制率//%
1.241..001.00
抑菌圈直径//cm抑制率//%
注：表中同列数据后不同小写字母表示差异显著，大写字母表示差异极显著。
不一致，菌落都较为湿润、易挑取；菌株HNSQSY04和HNSQSY31来自惠楼山药，菌落较小，边缘不规
图2复筛（HNSQSY04
则，且菌落较薄，革兰氏染色分别呈紫色、红色，细胞都呈杆状，且前者有芽孢（图3）；HNSQSY14和HNSQSY24来自铁棍山药，菌落较大，边缘规则，呈乳白色和浅棕色，革兰氏染色呈红色，为革兰氏阴性菌，无芽孢。
2.4拮抗菌的生长特征
拮抗菌的生长特征见图4。菌株HNSQSY04和
没有抑制作用。
2.3菌株形态学鉴定情况
菌株形态学鉴定结果见表2、表3、图3。由表2、表3可知，拮抗菌分别分离自惠楼山药的底部、上部以及铁棍山药的中部。筛选出的4株菌株的颜色
表2菌株的菌落特征
菌株HNSQSY31HNSQSY14菌株来源惠楼山药（底部）惠楼山药（上部）铁棍山药（中部）铁棍山药（中部）
菌落大小较小较小较大较大
菌落边缘不规则不规则规则规则
菌落颜色粉红色乳白色乳白色浅棕色
菌落厚度较薄较薄较厚较薄
含水量湿润湿润湿润湿润
透明度不透明半透明不透明半透明
正反颜色一致一致一致一致
挑取难易易挑取易挑取易挑取易挑取
菌株HNSQSY14HNSQSY24革兰氏染色
紫色红色红色红色
拮抗菌特征
结果G-G-芽孢有无无无
形状杆状短杆状短杆状杆状
大小//μm2.2~3.52.1~2.6生长期较短，培养9h已进入稳定期；而HNSQSY14和HNSQSY31在培养8h后进入对数生长，14h后进入稳定期，约31h后，4株菌株可能因产生的次生代谢产物或营养匮乏开始进入衰亡期。
根据菌株的菌落特征，革兰氏染色、芽孢染色和菌体形态、大小特征，根据参考文献[12，13]进行鉴定，HNSQSY04符合芽孢杆菌属特征，HNSQSY14、HNSQSY24和HNSQSY31均有杆菌的特征。
1.41.21.00.80.60.40.20
图3HNSQSY04
的革兰氏染色照片
HNSQSY24的潜伏期较短，4h开始进入对数生长期，可见这2株的适应能力均较强，但后者的对数
图4细菌生长曲线
第10期赵龙飞：拮抗性山药内生菌的分离和筛选2321
3小结与讨论
菌株中发现有1）以山药为材料4株对枯草芽孢杆菌有抑菌作用，在从山药中分离出的34株，占总菌数的11.76%，抑菌率均在24%以上，其中菌株HNSQSY04对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最为明显，抑菌率达52%。而对大肠杆菌仅有1株有抑制作用。说明来自同一种宿主的内生菌对不同病原菌有不同的抑菌活性。但是内生菌在活体上对病原菌的抑制能力是否和体外一致，还需进一步的验证。
形成互相依赖2）植物内生菌与寄主植物经长期的协同进化、和谐共处的关系，寄主植物为内生，菌提供生境和生长发育所需的营养，植物体内有些内生菌对病原物具有拮抗作用或诱导寄主植物产生抗性，从而提高寄主植物的抗病性[14]物病害的内生菌是一种潜在而丰富的生防资源，能控制作。内生菌在植物体内长期进化，可能拥有部分与宿主相同的基因，也可产生与宿主相同或相似的活性成
理研究提供材料，宿主可为进行内生菌代谢产生活性成分的机。
的内生菌株都属于杆菌3）本试验从铁棍山药和惠楼山药中分离得到，但具体的种属划分还需对内生菌进行生化试验、16SrDNA序列测定等进一步研究。这些菌株能否增加山药的抗病性，能否对除试验所用病原菌以外的病原菌有抑菌作用，还需进一步研究。
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（责任编辑陈焰)
拮抗性山药内生菌的分离和筛选
作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：
赵龙飞， ZHAO Long-fei
商丘师范学院生命科学学院,河南 商丘,476000湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences2014(10)
本文链接：http://d..cn/Periodical_hbnykx.aspx
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