请问一个基因的启动子区域是特异的吗,比如:这个启动子区域能上调它所属的基因,那它能上调其它基因吗?我们在研究启动子区域的活性时,后面融合表达的是诸如绿色荧光蛋白的序列,来检测荧光的强弱,从而判定启动子的活性,
按你限定的范围,启动子当然只能上调它所属的基因,但这只是结构决定功能,并不涉及到启动子的特异性,它的特异性应体现在与转录因子结合上,顺便说一下,增强子倒是可以远距离调控基因表达,至于后面的启动子区域活性,在同时提供给启动子启动时所需的转录因子的情况下,可以通过同一基因的表达水平,即荧光强度来比较分析不同启动子的转录效率.
为您推荐：
其他类似问题
基因上有编码区和非编码区,编码区又有内含子外显子连接基因之间的不编码区域叫基因间区在某一基因中有一个启动子,这个不编码蛋白质其他部分编码编码产生前
特异的，用GFP来定量没有多大意义吧？可操作性不强！还是用RTPCR来做吧
是特异的。启动子是一段RNA聚合酶特异性DNA识别序列。对于正常的启动子,从它之后的基因都能表达。绿色荧光蛋白基因是用来标记含有经改造的基因并观察它能否表达,与活性无关。
扫描下载二维码工具类服务
编辑部专用服务
作者专用服务
电离辐射对不同启动子驱动的GFP报告基因表达的影响
目的研究电离辐射调控脂质体介导的EGR-1基因启动子、CMV启动子驱动的GFP报告基因在人肝癌7402细胞内的表达.方法利用CMV启动子、EGR-1基因启动子构建pcDNA3-CMV-GFP、pcDNA3-EGR-GFP重组质粒,经阳离子脂质体LipofectAMINE介导转染人肝癌7402细胞株,对脂质体转染条件进行优化,在最佳转染条件下,分别给予不同浓度H2O2、不同剂量γ射线处理转染细胞,用荧光显微镜、流式细胞仪(FACS)检测GFP的表达情况.结果FACS 检测显示氧自由基、电离辐射可诱导EGR-1基因启动子驱动的GFP基因表达,而不诱导CMV启动子驱动的GFP表达.结论EGR-1基因启动子具有电离辐射诱导特性.
作者单位：
上海第二医科大学生物化学教研室人类基因治疗研究中心,上海,200025
第九人民医院放射科
年，卷(期)：
机标分类号：
在线出版日期：
基金项目：
国家自然科学基金
本文读者也读过
相关检索词
万方数据知识服务平台--国家科技支撑计划资助项目（编号：2006BAH03B01）(C)北京万方数据股份有限公司
万方数据电子出版社查看: 6531|回复: 12
积分458&威望458 &包包2196 &
积分458&威望458 &包包2196 &
想把特定的启动子与GFP连接进去病毒表达载体构成报告基因，病毒转染细胞后，观察细胞分化过程中的基因表达窗。想请教下一般用什么质粒载体？如果要筛选稳定细胞株是不是还需要加上筛选基因，还是GFP就够了？启动子一般是UCSC中查找-2000bp至+100bp吗？提取DNA对特定启动子PCR容易吗？谢谢！
欢迎参与讨论
总评分:&威望 + 2&
包包 + 10&
积分2279&威望2279 &包包4997 &
积分2279&威望2279 &包包4997 &
本帖最后由 懵懂干细胞 于
21:11 编辑
$ K& h: `1 [, s* j
光是GFP好像是不太够的哦，有的细胞假阳性的表达GFP，后面会丢失的也有。当然理论上是越多标记基因越好，但是过大会给工作带来苦难，建议可以考虑加个抗性基因，NEO PAC等等，
欢迎参与讨论
总评分:&威望 + 8&
包包 + 15&
把胚胎干细胞板块顶起！顶起！狂顶起！
积分458&威望458 &包包2196 &
积分458&威望458 &包包2196 &
5 Q& P1 x( M% m
谢谢建议！再请问下一般用什么载体构建比较好呢？
积分192&威望192 &包包508 &
积分192&威望192 &包包508 &
其实这个跟载体关系不大，跟你所筛选的启动子有关，我曾做过类似的实验，建议可以使用pEGFP-C1,将CMV启动子换成你所用的特定启动子，启动GFP的表达，同时还存在NEO筛选标记，这样就可以筛选稳定细胞株了~-足够~扩增启动子时需要用基因组做模板，也就意味着存在一定的困难，建议你可以预实验一下，如果一次扩出最好，如果不行可以采用重叠延伸PCR或者其他方法来分步扩增~Good luck!
欢迎参与讨论
总评分:&威望 + 20&
包包 + 30&
积分278&威望278 &包包1310 &
积分278&威望278 &包包1310 &
我以前构建过启动子的报告载体，一般来说查找-2000bp至+100bp的基因序列已经足够；当时我使用Touch Down的方法进行PCR，还是很容易扩增的，只要你的引物和模板没问题；你可以考虑一下pEGFP-1载体，这是增强型的GFP，表达效果还是不错的，上面有Kan和Neo的抗性基因，这是载体图谱。
10:42 上传
下载次数: 0
下载积分 威望 -2 , 包包 -5
56.75 KB, 下载次数: 0
欢迎参与讨论
总评分:&威望 + 10&
包包 + 20&
积分458&威望458 &包包2196 &
积分458&威望458 &包包2196 &
回复 7 l/ M7 ~5 ?% T4 m0 B
谢谢，但是pEGFP-C1这一系列的质粒只能用于瞬转吧，转染human ESC很困难吧？
欢迎参与讨论
总评分:&威望 + 1&
积分433&威望433 &包包1018 &
积分433&威望433 &包包1018 &
回复 - _, a! g& ]7 A) `
9 N" K9 E* u&&Z
用慢病毒载体构建质粒然后包装病毒感染
欢迎参与讨论
总评分:&威望 + 3&
包包 + 10&
积分144&威望144 &包包410 &
积分144&威望144 &包包410 &
病毒转导不太了解，请知道的童鞋给普及一下。
以前做过质粒转肿瘤细胞的稳定转染系，pEGFP-C1上带有G418抗性基因，转染后用G418进行筛选，可以得到很好的效果，但筛选过程是个技术活，有兴趣可以和我深入交流。, e* T! M/ b$ R" [; X! u: B! t
MSC是否适用于这种转染方式不确定，毕竟干细胞的传代能力不如肿瘤细胞。
欢迎参与讨论
总评分:&威望 + 8&
包包 + 15&
积分850&威望850 &包包37 &
积分850&威望850 &包包37 &
欢迎参与讨论
总评分:&威望 + 2&
包包 + 10&
积分192&威望192 &包包508 &
积分192&威望192 &包包508 &
一般用于瞬转，但是你想整合的话可以用慢病毒载体，这个可以进行基因组整合，pCDH系列载体还可以，可以查阅一下~ESC细胞转染确实是个问题，脂质体转染方法较多，所以普通载体确实较难整合，但是也不排除确实有整合的细胞，利用筛选标记进行筛选，还是可以得到稳定整合的细胞的，不过G418筛选时间较长，ESC细胞可能会扛不住，若可以选择用puro进行筛选，效果应该会好一些~仅仅是建议~
欢迎参与讨论
总评分:&威望 + 10&
包包 + 20&
Powered by绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取-五星文库
免费文档下载
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取
导读：绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取，目的：研究绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取，方法：从E.coliDH5中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒p，然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒，再用限制性内切酶BamHI和NotI对
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取
南方医科大学
2011预防医学（卫生检验检疫）
目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从E.coli DH5中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取
1 前言 ................................................................... 3
2 实验目的................................................................ 4
3 实验设备................................................................ 4
4 材料及试剂 .............................................................. 5
5 实验操作步骤 ............................................................ 5
5.1 操作流程 .........................................................................................................................................................5
5.2 质粒DNA的分离与纯化 ..............................................................................................................................6
5.2.1 质粒的培养 .............................................................................................................................................6
5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 ........................................................................................................................6
5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 ........................................................................................................................7
5.3 酶切及连接 .....................................................................................................................................................8
5.3.1 双酶切 .....................................................................................................................................................8
5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） ............................................................................8
5.3.3 连接 .........................................................................................................................................................9
5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 ..............................................................................................................9
5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录） ............................................................9
5.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法) .............................................................................................................9
5.4.3 转化涂板 ............................................................................................................................................... 10
5.5 GFP蛋白的诱导表达.................................................................................................................................... 10
5.6 绿色荧光蛋白的粗提取 ............................................................................................................................... 11
参考文献 ................................................................ 11
附录 .................................................................... 12 1 LB培养基的配制： ......................................................................................................................................... 12 2. 溶液Ⅰ ............................................................................................................................................................. 12 3. 溶液Ⅱ ............................................................................................................................................................. 12 4. 溶液Ⅲ（100ML） .......................................................................................................................................... 12 5. DNASE-FREE RNASE A ..................................................................................................................................... 13
6.TE缓冲液（PH8.0） ....................................................................................................................................... 13 7. 20×TBE ............................................................................................................................................................ 13 8. GENEFINDER-溴酚蓝上样缓冲液 .................................................................................................................... 13
9．PEGFP-N3质粒全图谱.................................................................................................................................. 13 10．PET-28A质粒全图谱 ................................................................................................................................... 14
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1]
GFP 作为一种新的报告基因，其优点在于①荧光强度高，稳定性高；②GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测；④GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域[ 2～3]。采用GFP 作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[ 4、5 ]。采用基因工程手段生产GFP标记的方法，可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[6]。
质粒转化进入大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞是分子克隆的关键步骤[7]，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。目前，感受态细胞的制备主要采用CaCl2法，该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率高，可广泛应用于一般的
实验室。其原理是Ca2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入[8]。
大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点[9]。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30%，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统[10]。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统,大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作,以及有大量可供选择的克隆或表达载体,使之成为人们克隆表达外源基因的主要菌株
随着科研的进展，构建出了多种具有不同特点的表达载体和工程菌株，以满足表达
不同性质、要求的目的基因的需要。在原核细胞中表达蛋白质的载体常用启动子有T7启动子、Trp启动子-色氨酸启动子、Tac启动子、T7噬菌体中基因10 的启动子及Lac启动子等。Lac启动子受分解代谢系统活化蛋白和cAMP的正调控和阻遏物的负调控，当加入乳糖或某些类似物IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使阻遏蛋白构型改变，阻遏蛋白不再能与操纵基因结合，从而使结构基因表达。根据原核生物基因表达特点选择载体进行目的基因克隆，然后转入相应的菌种中表达目的蛋白质[12]。
研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。
2 实验目的
学会绿色荧光蛋白基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达整个过程中的每一步，掌握其方法。本实验是通过基因工程手段对目的基因EGFP进行克隆，并进行EGFP表达载体的构建，并在大肠杆菌中诱导表达，获得GFP蛋白。
①学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法
②学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳技术
③学会用限制性内切酶切割DNA
④学会用琼脂糖凝胶中回收DNA片段
⑤学会DNA片段的体外连接技术
⑥学会用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
⑦学会用质粒DNA转化感受态受体菌的基本操作技术
⑧学会用酶切法筛选重组质粒转化成功的克隆菌
⑨了解外源基因在原核细胞中表达的特点和IPTG诱导表达的方法
⑩学习SDS-PAGE胶的基本灌制方法和用SDS-PAGE检测表达蛋白
3 实验设备
恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，核酸电泳仪，小型混合器，冰箱，蓝盾可见光透射仪，移液器、电泳槽、振荡器、制冰机、凝胶成像仪，水浴锅，高压灭菌锅、振荡培养箱，手持式紫外灯。
包含总结汇报、人文社科、办公文档、专业文献、经管营销、外语学习、IT计算机、教程攻略、考试资料以及绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取等内容。本文共4页
相关内容搜索GFP在植物分子生物学研究中的应用_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
GFP在植物分子生物学研究中的应用
上传于||暂无简介
阅读已结束，如果下载本文需要使用1下载券
想免费下载本文？
定制HR最喜欢的简历
你可能喜欢}