您的位置： &
干燥综合征唇腺组织中Bcl-2和Bax蛋白表达的意义
优质期刊推荐KeywordsSj(o|¨)gren’s syndrome, Labial glands, Suppression subtractive hybridization, RT-PCR, Immunohistochemistry
全文下载：
&&&&&&&&目的通过构建干燥综合征（sj（?）gren’s syndrome，SS）患者唇腺组纵cDNA差减文库，筛选SS患者唇腺中异常表达的基因，从中选择若干可能与SS发病机制相关的基因作为研究对象，从mRNA水平、蛋白质水平进行研究，并结合临床检验指标进行分析，初步探讨这些基因在疾病发生、发展中的作用。研究对象唇腺组织全部来自2004年9月～2006年4月间在北京协和医院口腔粘膜科接受唇腺活检的患者。分原发SS和正常对照两组，原发SS的入选标准要符合2002年SS国际分类（诊断）标准，除外同时合并其它结缔组织病的患者。对照组选择标准是：有口干或眼干主诉，但SFR和眼科滤纸实验检测均正常，自身抗体阴性，唇腺病理正常，同时除外合并其它基础病变。另外还包括部分唇腺囊肿患者或下唇外伤的患者，收集病变组织周围或清创组织中的正常唇腺作为研究材料，除外伴发其它全身疾病的患者。两实验组间的年龄比较经统计学检验无显著性差异。所有参与本实验的患者在进行唇腺活检前均被告知，活检取出的唇腺除送病理科行常规检查外，还将有部分唇腺样本用于SS发病机制的基础研究，获得研究对象同意后留取唇腺活检的部分标本用于本次研究。详细记录参与本实验患者的临床资料，包括年龄、性别、SFR、腮腺造影、滤纸实验、泪膜破裂时间、角膜染色、ANA、抗SSA抗体、抗SSB抗体、RF、免疫球蛋白（Ig）、ESR、唇腺活检病理等。方法1．SS唇腺组织中cDNA差减文库的构建：利用TRIR（Total RNA IsolationReagent，ABgene）分别提取SS和正常对照唇腺中总RNA，利用差减PCR试剂盒(Clontech PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit，Clontech)进行差减杂交，将杂交产物转入载体，构建正、反两个差减文库。2．异常表达基因的筛选：随机挑选768个克隆与核素([α-32P]-dATP)标记的PCR第二轮产物进行杂交，进行Northern blot验证，选择杂交信号Ratio值大于2的克隆进行测序，所用引物为SP6和T7（Sequenase V2．OKit，UK），在ABI377测序仪（美国Perkin-Elmer公司产品）单向测序，将得到的序列在www.ncbi.nlm.nih.gov网上进行比对，得到GeneBank号和基因名称等有关信息，查阅文献，选择与SS发病可能有关的基因做为研究的目标基因。3．目标基因的mRNA定量分析：根据目标基因的序列设计特异性引物，同时合成内参基因的引物进行RT-PCR扩增，PCR产物电泳后扫胶进行半定量分析。4．蛋白质表达的免疫组化分析：用中性福尔马林固定，石蜡包埋的唇腺切片做底物，用山羊抗人MUC5B亲合纯化多克隆抗体（Santa Cruz）进行免疫组化染色，使用Image-Pro plus5.0病理图像分析软件测定视野内棕色颗粒沉积的累计光密度，以此代表蛋白表达量。5．观测结果建立Excel数据库，使用SPSS11.0（Statistics Pakage for Social Science）软件进行统计分析，比较SS组和正常对照组间的差异，将目标基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平与临床检验结果进行相关性分析，P小于0.05认为具有统计学意义。结果1．SS组和正常对照组患者年龄比较，经过t检验，p＞0.05，没有统计学差异，说明这两组人群在年龄方面存在可比性。2．成功构建SS唇腺cDNA的差减文库，随机挑选768个克隆，经Northern blot验证Ratio值大于2的有99个克隆，其中上调51个，下调48个，经过测序得到63个200-700bp的序列片断，上网比对，与GenBank已收录的基因符合率在98％以上。3．经过半定量PCR分析，MUC5B和MUC7基因在两组间的表达存在显著性差异，t值分别为2.4和2.3，P值分别0.032和0.021，说明这两个基因在SS患者唇腺中表达明显低于正常对照。4．MUC5B和MUC7 mRNA的表达量分别与病程、SFR、Igγ％、ESR、RF、唇腺中淋巴细胞浸润灶评分（LFS）、抗SSA抗体滴度进行相关分析，发现SS患者唇腺中这两个基因表达量与LFS和抗SSA抗体滴度呈显著负相关，MISC5B与这两个因素的Pearson相关系数分别为-0.387和-0.474，P值分别为0.032和0.013；MUC7与这两个因素的Pearson相关系数分别为-0.386和-0.595，P值分别为0.032和0.001。多元回归分析证实这两个基因表达量只与抗SSA抗体滴度相关，MUC5B和MUC7的回归系数分别为-0.714和-0.708，P值分别为0.001。5．MUC5B免疫组化分析：MUC5B主要分布在腺泡细胞上，导管细胞少量着色，说明该蛋白主要由腺泡细胞表达。SS患者唇腺中MUC5B蛋白的表达明显低于正常对照。6．MUC5B蛋白表达量分别与病程、SFR、球蛋白γ％、ESR、RF、唇腺中LFS、抗SSA抗体滴度进行相关分析，发现SS患者唇腺中蛋白表达量与LFS、抗SSA抗体滴度呈显著负相关，与MUC5B mRNA表达量呈正相关，Pearson相关系数分别为-0.3396，-0.546和0.750，P值分别为0.041，0.003和0.000。多元回归分析证实只有MUC5B mRNA表达水平与蛋白表达水平相关，回归系数别113.664，P值为0.000。结论1．抑制性差减杂交方法可用于风湿病发病机制的研究，是初步高通量筛选异常表达基因的用力手段。2．成功构建了SS患者唇腺cDNA差减文库，SS患者唇腺中存在异常表达的基因。利用差减文库筛选出来的基因部分可能与SS发病相关，可以作为目标基因进一步研究。3．MUC5B和MUC7mRNA的表达在SS患者唇腺组织中是明显低于正常对照。与疾病的活动性无关，主要与抗SSA抗体滴度相关，提示自身抗体在其中起主要作用。4．MUC5B和MUC7的基因表达的变化同步，影响表达变化的因素相同，提示可能是同一机制导致两种基因表达的变化。5．MUC5B蛋白表达与LFS和抗SSA抗体滴度呈负相关，与MUC5B基因表达呈正相关，多元回归分析显示MUC5B基因表达降低是MUC5B蛋白表达下降的主要因素。
&&&&ObjectivesTo constructing two cDNA subtracted libraries and screen the abnormal expression of gene in labial glands from Sjogren’s syndrome（SS） Patients. Then some genes that may be associated with SS were selected for studying pathogenesis at level of mRNA and protein.MaterialsThe biopsy specimens of labial gland from Sjogren’s syndrome and control patients were collected in the stomatological clinic of Peking Union Medical College Hospital from September in 2004 to April in 2006. The subjects were divided into two groups: One was the primary Sjogren’s syndrome（pSS） that was calibrated by the American-European consensus criteria for SS（2002） and excluded those with other connective diseases. The other group acted as controls. Some had only complaint of eye-dry and/or mouth-dry, the objective tests such as salivary flow rate, Shirmer test, autoimmuoantibodies and labial gland biopsy study were normal. Others were labial trauma or lip cyst without systemic disease. The difference of age between two groups was not significant tested rmed consent was obtained from all tissue donors and information of patients and results of clinical tests was obtained from clinical record.Methods1. Constructing the subtracted cDNA library: Total RNA was isolated with TRIR （Total RNA Isolation Reagent, ABgene） from biopsy specimens of labial glands. Then subtractive hybridization using Clontech PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit, （Clontech） enabled us to compare two populations of mRNA and obtained two subtracted libraries. The different expressed clones were directly inserted into an A/T cloning vector to construct forward and reverse cDNA libraries.2. Selecting different expressed genes: 384 clones randomly selected from forward and reverse libraries respectively hybrided with probes, the second PCR products marked with [α-32P]-dATP. The clone that signal ratio was more than 2 or less than 0.5 was sequenced by primers SP6 and T7 on ABI 377 sequencor （Perkin-Elmer）. The sequences were blasted on www.ncbi.nlm.nih.gov and obtained Genebank ID and gene names. After reviewing literature, some genes associated with SS were selected as target genes for further studying.3. Semi-quantitative analyzing mRNA of target genes: After specific primer synthesized based on the sequences of target genes and house-keeping geneβ-actin, the target genes andβ-actin acted as templates to perform reverse transcript polymerase chain reaction （PCR）. The PCR products showed bands on gel after electrophoresis, Then mRNA expression of target genes were semi-quantitated by the OD ratio of the target genes toβ-actin bands under densitometry.4. Immunohistochemistry: Neutral-buffered formaldehyde fixed, paraffin-embedded tissue sections （4 um） were mounted on slides. The slides were incubated with diluted MUC5B（1:5 diluted） polyclonal antibody （Santa Cruz） and MUC5B-positive acini were shown brown under microscopy. Sum of intensity of brown stain in insights was calculated automatically by compute with the Image-ProPlus 5.0. The sum of intensity indicated the quantity of protein.5. Statistics analyzing: After constructing database by Excel, Comparing between two groups and correlation study was used the software of Statistics Pakage for Social Science （PSS11.0）. When P is less than 0.05, the statistics significance is confirmed.Results1. There was not significant different between the age of two groups by t test. The age was comparable in two groups.2. 99 out of 768 randomly selected clones were different expressed confirmed by Northern blot, which ratio was more than 2 or less than 0.5.63 clones were sequenced successfully and blasted on internet. The coincidence of base pair was over 98%. The name and GeneBank ID of these clones were obtained.3. MUC5B and MUC7 were found lower expressed in SS group than controls after semi-quantitative PCR. Statistics test was done, t was 2.4,2.3 respectively and P was 0.032, 0.021 respectively.4. The mRNA transcription of both MUC5B and MUC7 in labial glands from Sjogren’s syndrome patients were negatively correlated with the lymphocyte focus score （LFS） and the titer of anti-SSA antibody. The coefficient of MUC5B between the factors was-0.387 and-0.474 respectively, the P was 0.032 and 0.013 The coefficient of MUC7 between the factors was-0.386 and-0.595 respectively, the P was 0.032 and 0.001 respectively. Multiple regression study indicated the two mRNAs only associated with the titer of anti-SSA antibody, the coefficient of MUC5B and MUC7 was 0.714 and 0.708 respectively, the both P were 0.001.5. The protein of MUC5B mainly distributed on the labial gland acini, the ducts were less staining. On the sections from Sjogren’s syndrome patient, MUC5B was decreased statistically （P＜0.05） comparing with that in controls.6. The protein of MUC5B in labial glands from sjogren’s syndrome patients was negatively correlated with LFS and the titer of anti-SSA antibody and was positively correlated with mRNA. The coefficient of MUC5B between 3 factors was-0.396, -0.546 and 0.750 respectively, the P was 0.041, 0.003 and 0.000 respectively. Multiple regression study indicated the only mRNA associated with protein of MUC5B, the coefficient was 113.664, the P was 0.000.Conclusions1. Supression subtractive hybridization is a powerful technique to compare two population of mRNA and obtain clones of genes that are expressed differently. This technique can be used for studying pathogenesis of autoimmune disease.2. The subtractive cDNA library of labial glands of SS was constructed successfully. There is a great number of genes different expressed in SS. Some clones screening from cDNA library may be the virulence gene of SS and it is necessary to study further more.3. The mRNA of MUC5B and MUC7 were lower expressed in labial glands of SS than that controls. The mRNAs lowing down might be take place at the early stage of disease and they were not associated with all clinical index but with the titer of anti-SSA antibody, it suggested that autoimmnoantigodies might play an important role.4. The MUC5B and MUC7 changed on common at the level of mRNA in course of disease and they had the same affect factors. It was indicated that the two gene expressing lowly on the same principle.5. The protein of MUC5B in labial glands from Sjogren’s syndrome patients was negatively correlated with LFS and the titer of anti-SSA antibody and was positively correlated with mRNA. Multiple regression study indicated the only mRNA associated with protein of MUC5B, these suggested that MUC5B mRNA was the immediate cause of the protein lowing down.
&&&&&&&&干燥综合征唇腺cDNA差减文库的构建和异常表达基因的筛选及其功能的初探英文缩略词表5-6中文摘要6-10英文摘要10-13试验设计和论文结构14-15前言15-17第一部分 干燥综合征患者唇腺组织cDNA差减文库的构建17-37&&&&实验目的17&&&&实验材料17-19&&&&实验方法和结果19-32&&&&附件一32-37第二部分 干燥综合征唇腺组织中异常表达基因的筛选37-66&&&&实验目的37&&&&实验材料37&&&&实验方法和结果37-43&&&&附件二43-49&&&&讨论49-57&&&&参考文献57-65&&&&结论65-66第三部分 目标基因mRNA水平的研究66-74&&&&实验目的66&&&&实验材料66-67&&&&实验方法67-68&&&&实验结果68-73&&&&附件三73-74第四部分 免疫组化法分析干燥综合征患者唇腺中MUC5B的表达及分布74-93&&&&实验目的74&&&&实验材料74-76&&&&实验方法76-77&&&&实验结果77-81&&&&讨论81-89&&&&参考文献89-92&&&&结论92-93综述一 异常表达基因筛选方法的比较93-101&&&&综述参考文献99-101综述二 唾液中粘蛋白的研究进展101-113&&&&综述参考文献108-113致谢113-114
本文地址：
延伸阅读：
相关期刊文献推荐
相关会议文献推荐
相关硕士文献推荐
相关博士文献推荐原发性干燥综合征患者唇腺组织中干扰素-γ Fas FasL的表达及意义--《第17次全国风湿病学学术会议论文集》2012年
原发性干燥综合征患者唇腺组织中干扰素-γ Fas FasL的表达及意义
【摘要】：正本研究通过检测原发性干燥综合征(pSS)患者唇腺组织中干扰素-γ、Fas、FasL的表达情况,探讨干扰素-γ、Fas、FasL在pSS患者和健康对照之间的表达是否有差异,以及干扰素-γ与Fas、FasL之间相互关系,进一步探讨干扰素-γ与Fas、FasL在pSS发病机制中的作用及意义。采用免疫组
【作者单位】：
【分类号】：R593.2【正文快照】：
本研究通过检测原发性干燥综合征(pSS)患者唇腺组织中干扰素一，、Fas、FasL的表达情况，探讨干扰素八、Fas、FasL在pSS患者和健康对照之间的表达是否有差异，以及干扰素，与Fas、F助L之间相互关系，进一步探讨干扰素一，与Fas、FasL在pSS发病机制中的作用及意义。采用免疫组
欢迎：、、)
支持CAJ、PDF文件格式，仅支持PDF格式
【相似文献】
中国期刊全文数据库
华红，徐治鸿，王晶，纪晓龙;[J];实用口腔医学杂志;1995年03期
余立强,王永梅;[J];口腔医学;2003年01期
张旭晨，宫凤春, 赵凤志，代欣;[J];承德医学院学报;1995年01期
小四岛梧郎;扈传午;;[J];河北医科大学学报;1982年04期
,袁威玲;[J];中华风湿病学杂志;2004年09期
汤艳春,王吉波;[J];山东医药;2003年28期
李小春,文竹咸,赵玉霞,刘继明;[J];中国医学科学院学报;1993年02期
肖林,胡静,杨军,周继祥,李慧增;[J];临床口腔医学杂志;2004年08期
,郑家伟;[J];国外医学.口腔医学分册;1994年04期
何志秀，陈列，王虎，黄雨梅;[J];华西医学;1995年04期
中国重要会议论文全文数据库
武云霞;梁萍;焦艳军;孙晓军;;[A];中华口腔医学会第六届全国口腔黏膜病学术会议论文集[C];2004年
俞大亮;厉小梅;俞宁;王喜梅;徐蓓;李向培;;[A];2011年华东六省一市风湿病学学术年会暨2011年浙江省风湿病学学术年会论文汇编[C];2011年
厉小梅;李向培;钱龙;汪国生;张宏;王小秋;陈柯;王怡平;;[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年
厉小梅;李向培;钱龙;汪国生;张宏;翟志敏;李庆;陈柯;王小秋;王怡平;;[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年
张军;俞创奇;王丽珍;;[A];第三次全国涎腺疾病学术会议论文汇编[C];2006年
李菁;赵岩;唐福林;;[A];首届全国中青年风湿病学学术大会论文汇编[C];2004年
李菁;杜德顺;赵岩;唐福林;;[A];第十届全国风湿病学学术会议论文集[C];2005年
张洁;;[A];第七届全国口腔黏膜病暨第五届口腔中西医结合大会论文汇编[C];2008年
汤艳春;王吉波;;[A];中华医学会全国风湿病学年会论文汇编[C];2003年
陈小青;林玲;;[A];首届全国中青年风湿病学学术大会论文汇编[C];2004年
中国重要报纸全文数据库
董怡;[N];科技日报;2007年
本版编辑?董怡
李天舒;[N];健康报;2007年
侯徐美;[N];医药养生保健报;2005年
王荧瑶;[N];台州日报;2011年
潘国平　实习生
左娟;[N];哈密日报(汉);2010年
吴双九;[N];平凉日报;2010年
记者 朱海斌;[N];吐鲁番日报(汉);2010年
李杰华;[N];太原日报;2010年
谢炜;[N];云南日报;2010年
赵泰文;[N];毕节日报;2010年
中国博士学位论文全文数据库
王玉华;[D];中国协和医科大学;2007年
丁大成;[D];中国协和医科大学;1994年
佟胜全;[D];中国协和医科大学;2006年
周炜;[D];中国协和医科大学;2001年
高丽霞;[D];中国协和医科大学;2008年
杨嘉林;[D];中国协和医科大学;1989年
李鸿斌;[D];中国协和医科大学;2006年
朱晓峰;[D];山东大学;2010年
许焕丽;[D];山东大学;2010年
范海涛;[D];吉林大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库
俞大亮;[D];安徽医科大学;2012年
李珍;[D];北京协和医学院;2011年
乔娜;[D];昆明医学院;2011年
汤艳春;[D];青岛大学;2003年
陈小青;[D];福建医科大学;2004年
杨西超;[D];第四军医大学;2009年
张清平;[D];福建医科大学;2008年
刘雪;[D];山东大学;2009年
王喜梅;[D];安徽医科大学;2009年
徐蓓;[D];安徽医科大学;2011年
&快捷付款方式
&订购知网充值卡
400-819-9993
《中国学术期刊（光盘版）》电子杂志社有限公司
同方知网数字出版技术股份有限公司
地址：北京清华大学 84-48信箱 知识超市公司
出版物经营许可证 新出发京批字第直0595号
订购热线：400-819-82499
服务热线：010--
在线咨询：
传真：010-
京公网安备75号}