免疫学检测——ELISA篇(抗体,抗原,免疫学,包被,夹心法)
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[免疫学检测——ELISA篇(抗体,抗原,免疫学,包被,夹心法)] 为了与上一篇概述衔接，先说说废话，从大的方面说ELISA属于酶免疫技术。 免疫酶技术是将酶作为标记物，标记抗体或抗原后，与相应的抗原或抗体发生反应，通过标记酶相应底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量的检测依据。 ? 目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），如果要分类的话，它属于异 [关键词:抗体 抗原 包被 免疫学 夹心法 显色 含量 载体]…
为了与上一篇概述衔接，先说说废话，从大的方面说ELISA属于酶免疫技术。 免疫酶技术是将酶作为标记物，标记抗体或抗原后，与相应的抗原或抗体发生反应，通过标记酶相应底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量的检测依据。
目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），如果要分类的话，它属于异相固相酶免疫技术。所谓异相是指在检测时不需要将酶标记抗原抗体和游离抗原抗体分开，所谓固相就是指的ELISA的96孔板固相载体了。看下面均相酶免疫测定的原理图：
ELISA的主要原理很简单，有这么三个：
1、包被 抗原或者抗体能以物理性吸附于固相载体表面，可能原理是蛋白质和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原抗体反应等免疫活性；
2、标记 抗原或者抗体可通过共价键与酶连接成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特点；
3、显色 酶结合物与相应包被在固相载体的抗原或者抗体结合后，也被固定在固相载体上，加入酶的底物之后可出现显色反应，根据反应的颜色深浅可计算抗原或者抗体的相对含量。
ELISA 实验设计
根据检测对象的不同，我分别给童鞋们介绍抗原的检测方法设计和抗体的检测方法设计。
抗原的检测设计
1、双抗夹心法 针对至少2个抗原决定簇的多价抗原。首先介绍一下抗原决定簇，抗原决定簇就是决定抗原性的特殊化学基团，也叫抗原表位，理论上一个抗原决定簇能诱导产生一种单克隆抗体（可能有童鞋又要问单克隆抗体是神马东东了，以后介绍啊）。由6－12氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（线性表位）组成或由不连续的蛋白质三维结构（构象表位）组成。临床上具有2个抗原决定簇的多价抗原有很多，比较常见有HBsAg、AFP、HCG等大分子抗原。检测步骤也简单，就是包被、洗涤、加样、洗涤、加样、洗涤、显色。具体说来是先将纯化的相应抗体包被在固相载体上，再加入待测样品，若其中含有待测抗原就会与固相抗体结合，洗掉杂质后，再加入酶标记的检测抗体进行反应，洗掉多于的酶标抗体后，加入底物显色，显色与否以及颜色的深浅就代表了待测抗原是否存在以及相对含量了，简单吧。
对于双抗夹心法检测大分子抗原要注意几点，1.固相抗体和酶标检测抗体一定是分别针对待测抗原的两个不同抗原决定簇，不然两个抗体就会为争同一个决定簇而打架，会出现假阴性的不良结果；2.如果检测的样本是血清，就要注意风湿病患者体内内风湿因子RF这种奇葩异种抗体的存在，它能够神奇地结合固相抗体和检测抗体，造成假阳性的不良结果；3.包被的固相抗体含量一定是高于样品中的抗原含量，不然检测到的含量会比实际含量低；4.如果有童鞋想高端省事一些，将待测样品与酶标检测抗体同时加入固相载体，在酶标检测抗体高于样品中的待测抗原的情况下，会出现假阴性结果，这种现象书本叫钩状效应。
针对小分子抗原。这种方法也可以用于大分子抗原，只是相对双抗夹心法这种强悍的策略，竞争法完全没有优势，所以竞争法只在检测小分子这个边缘地带发挥余热了。临床上主要用于T3、T4、孕酮等激素以及药物等。检测步骤与双抗夹心法更简单，包被、洗涤、加样、洗涤、显色，少了一步加样的过程，但是设计上复杂一些，首先将纯化的相应抗体包被在固相载体上，然后每组样本需要分两组，一组同时加入事先混匀好的酶标检测抗原和样本的混合物，一组只加入酶标记抗原，两组颜色只差便是待测抗原的含量，有点晕啊。
对于竞争法也需要注意一点，酶标记抗原和待测样本一定要事先混匀好，然后同时加入固相载体，不然会造成不公平竞争，检测出现偏差；
抗体的检测设计 就方法来说，有间接法、双抗原夹心法、竞争法和捕获法四种设计。
1、 间接法，这个是检测抗体最常用也最简单的方法。操作步骤与双抗夹心一样，只是包被是纯化的相应抗原而不是抗体了，加入样品后洗涤，再加入的酶标记抗抗体，然后显色，颜色深浅与样品中待测抗体的浓度正相关。这个间接法的原理和步骤与双抗夹心一样一样的，为了区分就把包被抗原检测抗体叫做间接法了，以此类推，之前的双抗夹心法也可以叫做直接法，命名其实就是这么回事，规则多了就容易让人糊涂。间接法也有一些自己的特点，1.酶标记抗抗体可选择性检测抗体的亚型，可用于鉴别感染时期，如果是IgM那么提示感染早期；2.酶标抗抗体检测抗体特异性不高，容易产生假阳性，如果封闭不完全，可出现全板阳性，挺吓人的。临床上常用该方法检测抗HCV抗体、抗HEV抗体、抗CMV抗体、抗HSV抗体、抗沙眼衣原体抗体等等。
2、 双抗原夹心法，这个完全是山寨双抗夹心法的。原理和步骤也与双抗夹心一样一样的，与间接法相比，具有优越的灵敏度和特异性，但不是很常用，因为就目前的技术条件，想得到能用于ELISA检测的纯化抗原还是有一定的难度。临床上常用于检测HIV抗体初筛，TP抗体和抗HBs抗体等，这些检测对特异性和灵敏度，准确性都要求特别高。
3、 竞争法，和检测抗原设计的竞争法完全一致，临床上用的不多，我仔细总结了一下两个很具有代表性的，也各具特点。1、抗HBc抗体，检测方法与抗原相同，包被抗原之后，分两组，一组加入预先混匀的酶标抗体和待测样品，一组只加入酶标抗体，两组的显色之差可代表待测抗体的相对含量，需注意的是待测抗体与酶标抗体是同一物质；2、抗HBe抗体检测，方法与抗原竞争法设计稍有区别，包被的抗HBe抗体后，检测也分两组，一组先加入酶标HBeAg再立即加入待测样品，一组只加酶标HBeAg，两组显色之差代表待测抗体的相对含量，这种设计中包被抗体和待测抗体是同一物质。值得注意的是混合组不是事先混匀再加入，而是先加入待测抗体后再加入酶标抗原。所有的这些复杂的注意事项确实很容易把人搞晕，但是童鞋们只需要记住一条，竞争很残酷，我们就要想尽一切办法保证竞争的公平性，这样就不会错。
4、 捕获法，这种方法比较少用，由于具有识别抗体类型的优点，仅用于需要早期诊断(early diagnosis)的急性感染或者具有爆发性感染的疾病，如HAV-IgM、HBc-IgM、ToRCH等等。原理还是逃不脱经典的双抗夹心，具体方法是先包被能识别抗体类别的抗抗体，洗涤后加样品，再洗涤，加酶标记抗原，洗涤后显色，这些步骤闭上眼睛都能写出来。
最后说两句，与抗原检测不同，抗体检测的设计不是根据抗体的结构特点了，这么多种设计方法，童鞋们用的时候就会选择障碍了，掌握2个原则，1.实验要求，如果需要特异性和准确性特别高，那肯定是双抗原夹心法，要求马马虎虎，那就间接法，如果要明确抗体类型，最好的选择就是捕获法了；2.实验成本，与纯化抗体不一样，有时候想要获得纯化的抗原是非常困难的，更别说两种不同的纯化抗原了，所以双抗原夹心法临床上用的并不多。
ABS-ELISA 顺便说一下ABS-ELISA设计，其实是和上面说的一样的，通过亲和素-素系统（ABS）方法显色反应，增加检测灵敏度而已，但是增加操作步骤与实验成本，而且现在单克隆抗体的技术越见成熟，抗体特异性和亲和力大大提高，灵敏度已经不是问题，所以这些次等装备已经不常用。
结果判定 最后和童鞋说说ELISA结果判定，分定性和定量两种。
对于定性试验，参比阴、阳性对照的吸光度，以P/N或者S/CO比值形式报告。
P/N比值是指（待测样本-空白对照）/（阴性样本-空白对照），一般以P/N≥2.1判为阳性，或许求知欲旺盛的童鞋会问，那么竞争法用P/N比值怎么判，呵呵，这里先不说，卖个乖，你可以百度或者私信我啊；
2. S/CO比值，S是待测样本吸光度值，CO为CUT-OFF值，通常取值阴性对照平均值的2.1倍。S/CO比值≥1为阳性，竞争法S/CO比值≤1为阳性。
定量检测没有什么可说的，老老实实做标准曲线，既锻炼实验操作能力，又可作为实验内部参照。 记得有这么个规定，定性检测不能目测判断，要凭借检测，定量要在每次实验都得与待测样本相同实验条件下绘制标准曲线，有一难度，但是为了对实验负责，你就从了吧。
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[关于ELISA的具体的操作问题(抗体,试剂盒,免疫组化,试剂)] 请问ELISA具体的操作流程是怎样的？要是不用ELISA专用试剂盒来做，而用买来的抗体来做，还要哪些试剂及材料？还有，用于做ELISA的抗体和用于做免疫组化的抗体有什么不同，谢谢！ 关键词:[抗体 试剂盒 试剂 免疫组化]…
请问ELISA具体的操作流程是怎样的？要是不用ELISA专用试剂盒来做，而用买来的抗体来做，还要哪些试剂及材料？还有，用于做ELISA的抗体和用于做免疫组化的抗体有什么不同，谢谢！
回复elisa有好多种方法，看你检测的应该是抗原吧，如双抗夹心，需要：抗体，抗原标准品，酶标板，显色用的酶及底物；间接法需要酶标记的二抗。我觉得做Elisa的抗体对亲和力要求比较高。免疫组化没做过，但是想一下，elisa一般最久要在3，4个小时内完成，亲和力低，则由于抗原抗体的反应平衡，抗原抗体反应不够，因而极大影响检测灵敏度。回复ELISA的技术要点　　ELISA的技术要点包括三个方面：试剂的制备、反应条件的选择和操作的标准化。　　一、试剂的制备　　ELISA的主要试剂为固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。以下叙述这些试剂的原料和制备方法。　　（一）固相载体　　可作ELISA中载体的物质很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。在ELISA测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应。加之它的价格低廉，所以被普遍采用。　　ELISA载体的形状主要有三种：小试管、小珠和微量反应板。小试管的特点是还能兼作反应的容器，最后放入分光光度计中比色。小珠一般为直径0.6cm的圆球，表面经磨砂处理后吸附面积大增加。如用特殊的洗涤器，在洗涤过程中使圆珠滚动淋洗，效果更好。最常用的载体为微量反应板，专用于ELISA测定的产品也称为ELISA板，国际通用的标准板形是8×12的96孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8联或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特定的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化用于微量反应板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。　　良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间和同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大。因此每一批号的聚苯乙烯制品在使用前须检查其性能。常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为10ng/ml）包被ELISA板各孔后，每孔内加入适当稀释的酶标抗人IgG抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各读数在0.8左右。计算所有读数的平均值。所有单个读数与平均读数之差应小于10％。　　与聚苯乙烯类似的塑料为聚氯乙烯。作为ELISA固相载体，聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。　　为比较不同固相在某一ELISA测定中的优劣，可用以下方法加以检验：用其它免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和一个典型的阴性标本。将它们分别进行一系列稀释后，在不同的固相载体上按预定的ELISA操作步骤进行测定，然后比较测定结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果判别最大，这种载体就是这一ELISA测定的最合适的固相载体。　　除塑料制品外，固相酶免疫测定的载体还有两种材料：一是微孔滤膜，如硝酸纤维素膜、尼龙膜等，这类测定形式将在本章第五节“膜载体的酶免疫测定”中介绍。另一种载体是以含铁的磁性微粒制作的，反应时固相微粒悬浮在溶液中，具有液相反应的速率，反应结束后用磁铁吸引作为分离的手段，洗涤也十分方便，但需配备特殊的。　　（二）抗原和抗体　　在ELISA实施过程中，抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键因素。本法要求所用抗原纯度高，抗体效价高、亲和力强。　　ELISA所用抗原有三个来源：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于动物组织或体液、微生物培养物等，一般含有多种抗原成分，需经纯化，提取出特定的抗原成分后才可应用，因此也称提纯抗原（purifiedantigen）。重组抗原（recombinantantigen）和多肽抗原（peptideantigen）均为人工合成品，使用安全，而且纯度高，干扰物质少。因此虽然制备合成抗原有较高的技术难度且要求较为昂贵的仪器设备和，其应用仍十分普遍，特别是对那些天然抗原不易得到的试验，更显出其独到之处。　　用于ELISA的抗体有多克隆的和单克隆的。抗血清成分复杂，应从中提取IgG才可用于包被固相或酶标记。含单克隆抗体的小鼠腹水中的特异性抗体含量较高，有时可适当稀释后直接进行包被。制备酶结合物用的抗体的质量往往要求有较高的纯度。经硫酸铵盐析纯化的IgG可进一步用各种分子筛层析提纯。也可用亲和层析法提纯特异性IgG，如用酶消化IgG后提取的Fab片段，则效果更好。　　（三）免疫吸附剂　　固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被（coating）。由于载体的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板为载体，通常将抗原或抗体溶于缓冲液（最常用的为pH9.6的碳酸缓冲液）中，加于ELISA板孔中在4℃过夜，经清洗后即可应用。如果包被液中的蛋白质浓度过低，固相载体表面有能被此蛋白质完全覆盖，其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地吸附于固相载体表面，最后产生非特异性显色而导致本底偏高。在这种情况下，如在包被后再用1％～5％牛血清白蛋白包被一次，可以消除这种干扰。这一过程称为封闭（blocking）。包被好的ELISA板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。　　（四）酶和底物　　ELISA中所用的酶要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。另外它的相应底物应易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定，光吸收高。ELISA中最常用的酶为辣根过氧化酶（HRP）和从牛肠粘膜或大肠杆菌(Escherichia coli)提取的碱性磷酸酶（AP）。　　HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，纯化方法也不复杂。它是一种糖蛋白，含糖量约18％；分子量为44kD；是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成的一种卟啉蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰；辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。HRP催化下列反应：　　上式中DH2为供氢体，H2O2O为受氢体。HRP对受氢体的专一性很高，除H2O2外，仅作用于小分子醇的过氧化物和尿素的过氧化物。后者为固体，作为较H2O2方便。许多化合物可作为HRP的供氧体，在ELISA中常用的供氢体底物为邻苯二胺（orthopenylenediamine，OPD）、四甲基联苯胺（3，3＇，5，5＇-tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS[2，2＇-azino-bis(3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6)]。　　OPD为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便。其缺点是配成应用液后稳定性差，而且具有致异变性。TMB无此缺点。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色，可在比色计中定量；因此应用日见增多。ABTS，虽然灵敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。HRP催化OPD的反应如下：　　HRP的纯度用RZ（ReinheitZahl，意为纯度数）表示，是403nm的吸光度与280nm的吸光度之比，高纯度的HRP的RZ≥3.0。应注意的是酶变性后，RZ可不变而活力降低，故重用酶制剂时更重要的指标为活力。酶活力以单位表示：1min将1μmol的底物转化为产物的酶量为1个单位。　　在ELISA中另一常用的酶为碱性磷酸酶。从大肠杆菌(Escherichia coli)提取的AP分子量为80kD，酶作用的最适pH为8.0；用小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kD，最适pH为9.6。一般采用对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作为底物。它可制成片状试剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。反应式如下：　　在ELISA中应用AP系统，其敏感性一般高于应用HRP系统，空白值也较低。但由于AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等原因，国内在ELISA中一般均采用HRP。　　除HRP和AP以外，在商品ELISA试剂中应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基伞基-β-D半乳糖苷（4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside），经酶水解后产生荧光物质4-甲基伞酮（4-mehtylumbelliferone），可用荧光计检测。荧光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可应用可产生荧光的伞基磷酸酯作底物。其缺点是需要荧光计测定，而且如用固相载体直接作为测定容器，此载体不可发出荧光。脲酶的特点是酶作用后反应液发生pH改变，可使指示剂变色；另外，在人体内没有内源酶（酶的化学发光底物见第十八章）。　　（五）结合物　　酶标记的抗原或抗体称为结合物（conjugate）。抗原由于化学结构不同，可用不同的方法与酶结合。如为蛋白质抗原，基本上可参考抗体酶标记的方法。制备抗体酶结合物的方法通常有以下几种。　　1．戊二醛交联法戊二醛是一种双功能团试剂，可以使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过它而偶联。戊二醛交联可用一步法（如连接AP），也可用二步法（如连接HRP）。举例如下：　　2～5mg纯抗体与5mgAP混合于0.1mol/LpH6.8的磷酸缓冲液1ml中，4℃下对同上缓冲液透析平衡。磁力搅拌下，缓慢加入1％戊二醛0.05ml，在室温下放置2小时。在4℃下对0.05mol/LpH8.0Tris缓冲液透析平衡，即得酶标抗体。　　辣根过氧化物酶可溶解于50％饱和度硫酸铵中。用上法交联后可用50％饱和度硫酸铵沉淀酶标抗体，弃去上清中游离酶。　　戊二醛一步法操作简便、有效，而且重复性好。缺点是交联时分子间的比例不严格，大小也不一，影响效果。　　制备HRP抗体结合物也可用二步法，即先将HRP与戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。此法的效率可高于一步法10倍左右。　　2．过碘酸盐氧化法本法只用于HRP的交联。该酶含18％碳水化合物，过碘酸盐将其分子表面的多糖氧化为醛基。用硼氢化钠（NaBH4）中和多余的过碘酸。酶上的醛根很活泼，可与蛋白质结合，形成按摩尔比例结合的酶标结合物。有人认为此法为辣根过氧化物酶交联最有效的方法。但也有只认为由于所用试剂较为剧烈，各批实验结果不易重复。　　按以上方法制备的结合物一般混有未结合的酶和抗体。理论上结合物中混有游离酶不影响ELISA中最后的酶活性测定，因经过洗涤，非特异性吸附于固相上的游离酶已被洗去。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因而减低结合到固相上的酶标抗体量。因此制备的结合物应予以纯化。纯化的方法较多，分离大分子混合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法操作简便，但效果不如用SephadexG-200凝胶过滤的好。　　二、最适工作浓度的选择　　在建立某一ELISA测定中，应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予以选择，以达到最合适的测定条件和节省测定费用。下面以间接法测抗体和夹心法测抗原为例，介绍最适工作浓度的选择方法。　　（一）间接法测抗体　　1．酶标抗抗体工作浓度的选择　　（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。　　（2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。　　（3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度（A），绘制曲线如图15-10。读取A值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。该酶标抗人IgG的工作浓度应为1/1600。　　2．棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度　　（1）用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，洗涤。　　（2）将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1:100稀释，加样，保温，洗涤。　　（3）加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体，保温，洗涤。　　（4）加底物显色。加酸终止反应后读取A值。　　（5）选择强阳性参考血清的A值为0.8左右、阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀释度作为工作浓度。表15-1为本例的测定结果，表中数字为A值。从表中可见1:200为最舒适的工作浓度。表15-1 间接ELISA法包被抗原工作浓度的选择各类血清 抗原稀释度 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 强阳性 1.20 1.04 0.84 0.68 0.42 弱阳性 0.64 0.41 0.30 0.22 0.19 阴性 0.23 0.13 0.08 0.66 0.05 稀释液 0.09 0.02 0.02 0.02 0.04 　　（二）夹心法测抗原　　在夹心法ELISA法中可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度，举例如下（表15-2）：表15-2 夹心ELISA包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择包被抗体的浓度及酶标抗体稀释度 参考抗原 强阳性（25ng/ml） 弱阳性（1.5ng/ml） 阴性 10μg/ml 　 　 　 1: 0.15 0.09 1: 0.03 0 1: 0 0 1μg/ml 　 　 　 1:1000 ＞2 0.25 0.10 1: 0.12 0.01 1: 0.01 0 0.1μg/ml 　 　 　 1: 0.13 0.13 1: 0.03 0.02 1: 0 0 　　（1）抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10、1和0.1μg/ml，分别在ELISA板上进行包被，每一浓度包括三个纵行，洗涤。　　（2）在一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，另一横行加入弱阳性抗原液，第三横行加入阴性对照液，保温，洗涤。　　（3）将酶标抗体用稀释液稀释成三个浓度，例如1:0和1:25000。分别加入每一包被浓度的一个纵行中，保温，洗涤。　　（4）加底物显色。加酸终止反应后，读取A值。　　（5）以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。从表15-2可看出包被抗体浓度可选用1μg/ml，酶标抗体的稀释度可选为1:5000。为了进一步节省试剂，可以此浓度为基点，缩小间距再做进一步的棋盘滴定。　　三、测定方法的标准化　　要使ELISA测定得到准确的结果，不论是定性的还是定量的，必须严格按照规定的方法制备试剂和实施测定。主要试剂的制备要点已如前述，其他一般性试剂，如包被缓冲液、洗涤液、标本稀释液、结合物稀释液、底物工作液和酶反应终止液等，配制时不可掉以轻心。缓冲液可于冰箱中短期保存，使用前应观察是否变质。蒸馏水的质量在ELISA中也至关重要，最好使用新鲜重蒸馏的。不合格的蒸馏水可使空白值升高。　　测定的实施中，应力求各个步骤操作的标准化，下面以板式ELISA为例，介绍有关注意事项。　　（一）加样　　在ELISA中除了包被外，一般需进行45加样。在定性测定中有时不强调加样量的准确性，例如规定为加样一滴。此时应该使用相同口径的滴管，保持准确的加样姿势，使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中则加样量应力求准确。标本和结合物的稀释液应按规定配制。加样时应将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出现气泡。　　（二）保温　　在ELISA中一般有二次抗原抗体反应，即加标本后和加结合物后，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。各ELISA板不应叠在一起。为避免蒸发，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。湿盒应该是金属的，传热容易。如用保温箱，空湿盒应预先放在其中，以平衡温度，这在室温较低时更为重要。加入底物后，反应的时间和温度通常不做严格要求。如室温高于20℃，ELISA板可避光放在实验台上，以便不时观察，待对照管显色适当时，即可终止酶反应。　　（三）洗涤　　洗涤在ELISA过程中不是反应聚，但却是决定实验成败的关键。洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯待塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的。因此在ELISA测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。在标本和结合物的稀释液和洗涤液中加入聚山梨酯（吐温，Tween）一类物质即右达到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，为非离子型的表面张力物质，常作为助溶剂。根据脂肪酸的种类而对聚山梨酯编号，结合月桂酸的为聚山梨酯20，在ELISA中最为常用。它的洗涤效果好，并具有减少非特异性吸附和增强抗原抗体结合的作用。　　洗涤如不彻底，特别在最后一次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。另外，在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净，也将与酶标抗体作用而产生干扰。　　ELISA板的洗涤一般可采用以下方法：①吸干孔内反应液；②将洗涤液注满板孔；③放置2min，略作摇动；④吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤的次数一般为3～4次，有时甚至需洗5～6次。　　（四）比色　　如阴性对照颜色极浅，在定性测定中一般可采用目视比色。如用比色计测定结果，准确性决定于ELISA板底的平整与透明度和比色计的质量。回复ELISA的原理和类型　　一、基本原理　　1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。　　二、方法类型和操作步骤　　ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。　　（一）双抗体夹心法　　双抗体夹心法（图15-4）是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：图15-4双抗体夹心法测抗原示意图　　（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。　　（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。　　（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。　　（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。　　根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。　　（二）双位点一步法　　在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。图15-5双位点一步法示意图　　在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。　　（三）间接法测抗体　　间接法（图15-6）是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：　　（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。　　（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。　　（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。　　（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。　　本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。图15-6间接法测抗体示意图　　（四）竞争法　　竞争法（图15-7）可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：　　（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。　　（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。　　（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。图15-7竞争法测抗原示意图　　（五）捕获法测IgM抗体　　血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法（图15-8），先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：图15-8捕获法测IgM抗体示意图　　（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。　　（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。　　（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。　　（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。　　（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。　　（六）应用亲和素和素的ELISA　　亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。　　亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。桥联法ABC-ELISA（avidinbiotincomplex-ELISA）夹心法测抗原的过程见图15-9。图15-9桥连法ABC-ELISA夹心法测抗原示意图回复谢谢各位！我还想问一个问题：双抗夹心法检测抗原，如果分子量小的话，是不是效果不好，那要用什么方法好些？谢谢！回复ELISA ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。 　　(一)　原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。　　(二)　操作步骤　　方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法:　　1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。　　2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。　　3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小时，洗涤。　　4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分钟。　　5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。　　6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。　　方法二　用于检测未知抗体的间接法：　　　　　　用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，　　　　　　每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔　　　　　　中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，　　　　　　37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。　　　　　　　　　　　　　　↓其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。　　(三)　试剂器材　　1.　试剂　　(1)　包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):　　　　　　NaHCO３
　NaHCO３　 2.93克　　　　　　加蒸馏水至1000ml　　(2)　洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M　　　　　　KH2PO4 　　　　　0.2克　　　　　　Na2HPO４·12H2O　　2.9克　　　　　　NaCl　　　　　　　8.0克　　　　　　KCl　　　　　　　　0.2克　　　　　　Tween-20　0.05％　0.5ml　　　　　　加蒸馏水至1000ml　　(3)　稀释液：　　　　　　　牛血清白蛋白(BSA) 0.1克　　　　　　　加洗涤缓冲液至100ml　　　　或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。　　(4)　终止液(2M　H２SO４）：??　　蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。　　(5)　底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸):　　　　0.2M Na２HPO４(28.4克／L) 25.7ml　　　　0.1M 柠檬酸(19.2克／L)　　　　　 24.3ml　　　　加蒸馏水50ml。　　　TMB(四甲基联苯胺)使用液:　　　　TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml　　　　底物缓冲液(PH5.5)　　　 10ml　　　　0.75％H２O２　　 　32μl　　(7)　ABTS使用液:　　　　ABTS　　　　　　　　0.5mg　　　　底物缓冲液(PH5.5)　 1ml　　　　3％H２O２　 　2μl　　　抗原、抗体和酶标记抗体。　　(9)　正常人血清和阳性对照血清。　　2.　器材:　　(1)　聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。　　(2)　小烧杯、玻璃棒、、吸管和量筒等。(3)　4℃冰箱，37℃孵育箱。　　(四)　注意事项　　1.　正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。　　2.　在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:　　(1)　固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。　　（2） 包被(或抗原)的选择：将(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃ 18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。　　(3)　酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。　　(4)　酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。回复请问ELISA具体的操作流程是怎样的？要是不用ELISA专用试剂盒来做，而用买来的抗体来做，还要哪些试剂及材料？还有，用于做ELISA的抗体和用于做免疫组化的抗体有什么不同，谢谢！关于流程大家已经介绍了不少了。如果您要自己建立ELISA kit，需要做不少的工作以及一些运气，夹心ELISA要求2个抗体识别的表位不同，而且对抗体的亲和力要求也较高。我个人认为，免疫组化的抗体和ELISA的抗体并不总是能同用的，在进行免疫组化时，有的抗原是经过变性处理的，因此您会发现组化抗体的说明里会介绍某某抗体只能用于某种方法处理的标本。我觉得如果没有丰富的ELISA和免疫学实验技术，最好还是买试剂盒比较好。关于分子的大小，大分子和小分子的好坏是相对的，分子太大会太小都会不利于ELISA检测，因为分子的大小直接影响了ELISA实验中抗原和抗体之间的空间接触。您检测的是什么分子，不放说出来，大家帮您看看。回复同意楼上的观点。做双抗夹心，需要一个包被抗体，一个酶标抗体以及相应的底物。为了保证试验结果的可靠性，还要建立适当的质控体系。如果只为了做几百个标本，如果可能还是买试剂盒吧，钱花得差不多，时间和精力节省很多。回复除了以上大家从一抗选择及可能性角度的分析，建立一种ELISA方法你最起码还要采用多因素棋盘滴定方法确定最佳实验条件，包括确定包被液的种类、包被抗体的浓度范围，以及一抗、的反应浓度等。最后，还应该验证该ELISA方法的灵敏度、工作范围、批内变异系数(CV)、批间CV 、可重复性、有无明显的交叉反应、特异性等。的确有很多工作要做。。。
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