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为了从泡菜汁中筛选分离出发酵产酸速度快、亚硝酸盐降解能力强的乳酸菌，科研人员做了如下实验（实验室中常用MRS培养基培养乳酸菌，在加入CaCO3的MRS培养基中，菌落周围能形成透明圈）。请回答问题：（1）在无菌操作下，使用无菌水对泡菜汁进行_________，将不同稀释度的泡菜汁涂布于添加了CaCO3 [乳酸菌、培养基、亚硝酸盐、菌落、降解、核膜、梯度、菌株]
为了从泡菜汁中筛选分离出发酵产酸速度快、亚硝酸盐降解能力强的乳酸菌，科研人员做了如下实验（实验室中常用MRS培养基培养乳酸菌，在加入CaCO3的MRS培养基中，菌落周围能形成透明圈）。请回答问题：（1）在无菌操作下，使用无菌水对泡菜汁进行_________，将不同稀释度的泡菜汁涂布于添加了CaCO3的乳酸细菌培养基（MRS培养基）平板上。在适宜条件下培养后，挑取有________ _的菌落，立即继续在MRS平板上用________法分离，得到单菌落。（2）加入CaCO3的MRS培养从功能上看属于________培养基。取分离到的乳酸菌接入MRS液体培养基中，间隔取样测定pH，目的是筛选出_______________的乳酸菌。（3）取上一步筛选出的乳酸菌接入含有NaNO2的MRS培养基中，培养一段时间后，用比色方法测定NaNO2的含量，筛选出_____________的菌株。（4）乳酸菌细胞结构的最主要特点是___________，其代谢类型为__________。
答案:（（1）（2）每空2分，（3）（4）每空1分，共13分）（1）梯度稀释 透明圈 平板划线（2）鉴别 产酸速度较快（3）亚硝酸盐降解能力强（4）没有核膜包围的细胞核 异养厌氧型【解析】试题分析：（1）首先对泡菜汁进行梯度稀释才能形成不同稀释度的泡菜汁，因为在加入CaCO3的MRS培养基中，菌落周围能形成透明圈所以要挑去有透明圈的菌落，然后用平板划线法分离提纯。（2）从功能上该培养基是鉴别培养基，想要的目的菌是产酸速度快，亚硝酸盐降解能力强的菌种，故测定pH是筛选出产酸速度较快的乳酸菌。（3）亚硝酸盐的测定用比色法，故筛选的是亚硝酸盐降解能力强的菌株。（4）乳酸菌是原核最主要的特点是没有核膜包围的细胞核，它是异养厌氧型生物。考点：本题考查微生物的培养与分离相关知识，意在考察考生对知识点的识记理解掌握程度及对知识点间综合把握运用能力。
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泡菜中植物乳酸菌的筛选与鉴定
摘 要：目的：对自然发酵泡菜盐水中的乳酸菌进行分离鉴定及特性研究。方法：乳酸菌分离采用倾注法使稀释样品与MRS培养基混合，然后在37℃中培养，再挑取乳酸菌在MRS培养基上进行划线分离。结果：试验成功地从泡菜盐
【题　名】泡菜中植物乳酸菌的筛选与鉴定
【作　者】唐鹏程 焦士蓉 闵甜 唐远谋 冯慧 刘佳
【机　构】西华大学生物工程学院 成都610039
【刊　名】《中国调味品》2011年 第3期 52-55页　共4页
【关键词】乳酸菌 形态特征 生化特征 生长曲线
【文　摘】目的：对自然发酵泡菜盐水中的乳酸菌进行分离鉴定及特性研究。方法：乳酸菌分离采用倾注法使稀释样品与MRS培养基混合，然后在37℃中培养，再挑取乳酸菌在MRS培养基上进行划线分离。结果：试验成功地从泡菜盐水中分离出一种植物乳酸菌菌株，并对其进行了形态特征、培养特征和生化特征鉴定，也对其生长曲线进行了测定和分析。在生化特征鉴定中，进行了革兰氏染色、H2S检验、明胶液化试验、H2O2试验、乳酸定性试验、碳水化合物发酵试验、精氨酸水解试验、运动性试验，根据结果可初步确定为植物乳杆菌。其生长曲线也满足细菌的典型生长曲线，有明显的延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期。结论：其在对数生长期时，pH变化最大，说明菌株的产酸性能迅速得到了提高。在稳定期时，该菌的产酸量达到最大值。
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四川地区自然发酵泡菜中乳酸菌的生物学特性研究
日期： 查看：5793
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 周光燕*，张小平**
摘要： 本研究从四川地区采集自然发酵泡菜汁样品34份，从中分离得到116株乳酸菌菌株，其中杆菌94株，球菌22株。以这116株未知菌株和15株已知参比菌株为研究对象，采用数值分类方法，对菌株的表型多样性进行了研究。同时对分离菌株的产细菌素能力进行了测定，将产细菌素能力强的乳酸菌人工接种于泡菜中进行发酵，探讨了人工接种乳酸菌对泡菜亚硝酸盐含量的影响。根据数值分类的结果，对菌株的种属进行了鉴定。
球菌数值分类中，菌株在75%相似水平上，只有10株菌株被聚为4个类群，表明从不同区域、不同材料来源的泡菜其乳酸菌生理特性较为复杂，有待进一步研究。杆菌在75%相似性水平上，94株乳酸杆菌被分为了24个菌群，并且来自同一样品的菌株分散到不同的群中，说明四川地区自然发酵泡菜中的乳酸杆菌，具有种类多样性。
&&&& 分离得到的乳杆菌属菌株分别归种为：干酪乳杆菌干酪亚种（L.casei subsp.casei）12株，棒状乳杆菌棒状亚种(L.coryniformis)9株，噬酸乳杆菌（L.acidophilus）2株，植物乳杆菌（L.plantarum）8株，瑞士乳杆菌（L.helveticus）1株，德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）1株，唾液乳杆菌水杨素亚种（L.salivarius subsp. salicinius）2株，戊糖乳杆菌（L.pentosus）4株，草乳杆菌（L.graminis）2株，绿色乳杆菌（L.viridescens）2株，肠乳杆菌 (L.intestinalis) 2株，玉米乳杆菌（L.zeae）9株，干酪乳杆菌假植物亚种（L.casei subsp.pseudoplantarum）4株，弯曲乳杆菌（L.curvatus）6株，棒状乳杆菌扭曲亚种（L.coryniformis subsp.torquens）3株，鼠乳杆菌（L.murinus）3株，类布氏乳杆菌（L.parabuchneri）3株，双发酵乳杆菌（L.bifermentans）2株，混淆乳杆菌（L.conllinoides）2株，耐盐乳杆菌（L.halotolerans）2株，食品乳杆菌（L.alimentarius）1株。
&&&& 分离得到的乳酸球菌分别归种为：乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis）1株，乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis）2株，植物乳球菌（L.plantarum）1株，粪肠球菌（E.faecalis）2株，屎肠球菌（E.faecium）1株，粪链球菌（Streptococcus）2株。
通过对分离得到的116株乳酸菌，经过筛选得到5株乳酸杆菌产细菌素，将所得5株菌人工接种到泡菜中进行发酵，与未接种的自然发酵比较，人工接种能显著减少泡菜中亚硝酸盐的含量。该5株乳酸杆菌分别为：A-13干酪乳杆菌干酪亚种（L.casei subsp.casei）、J-5棒状乳杆菌棒状亚种(L.coryniformis)、6-7鼠乳杆菌（L.murinus）、7-4干酪乳杆菌假植物亚种（L.casei subsp.pseudoplantarum）、A-7弯曲乳杆菌（L.curvatus）。
关键词：自然发酵泡菜；乳酸菌；多样性；细菌素；亚硝酸盐
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&*作者简介：周光燕，女，硕士，2006年6月毕业于四川农业大学，现在四川食品发酵研究设计院
&&&&&&&&&&&&&&&&& 菌种站从事微生物菌种资源保藏管理与开发应用。
**通讯作者：张小平教授
&&&& 泡菜是一种以白菜、萝卜、黄瓜、甜椒等新鲜蔬菜为原料，添加食盐、水和调味料，利用蔬菜自身附着的微生物或添加人工培养的乳酸菌发酵剂，在厌氧环境下进行乳酸发酵而成的深受消费者喜爱的特色风味食品。泡菜不但味美爽口，而且具有丰富的营养，含有VA、VB1、VB2、VC、Ca、P、Fe、胡萝卜素、辣椒素、纤维素和蛋白质等多种丰富的营养成分。由于泡菜在发酵过程中，乳酸菌利用蔬菜中的可溶性养分进行乳酸发酵，既不具备分解纤维素的酶系统，也不具备水解蛋白质的酶系统。因此，它们既不破坏植物细胞组织，也不使蛋白质和氨基酸分解。并且在发酵过程中产生大量乳酸，既起防腐作用，又可以改善产品风味（杨洁彬，郭兴华等，1996）。
&&&& 一般自然发酵的泡菜在发酵初期以异型乳酸菌迅速启动发酵，产生有机酸、过氧化氢和细菌素等物质，有效抑制一些腐败微生物及其它厌氧微生物如丁酸细菌的生长、繁殖，是得到优质安全泡菜产品的重要保证（江汗糊，2002；施安辉，周波，2002）。同时伴随乙醇、乙醛、甘露醇等风味物质产生，对泡菜特有风味的形成起决定作用；之后同型乳酸菌逐渐成为优势菌，进一步降低环境pH值和抑制有害杂菌（凌代文，东秀珠，1999；NANCYJ G,Tont S,2001）。在发酵结束后，泡菜中含有大量有机酸、细菌素、益生素等（Hurst A.J 1972）。泡菜可以调节动物和人体肠道微生态平衡，对机体的健康十分有益，包括抑制肠道中腐败菌的生长和减弱腐败菌在肠道的产毒作用，并有帮助消化，防止便秘，防止细胞老化，降低胆固醇，抗肿瘤以及调节人体生理机能等保健和医疗作用（J.Delves-Broughton,1990;Hurst A.J 1972;R Yang,M.C.Johnson,1992）。
&&&& 乳酸菌（Lactic acid bacteria, LAB）是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的统称。在自然界广泛分布，可在土壤，污水，生长的植物上，动物消化道、体表，人体消化道、生殖道中分离得到（杨洁彬，郭兴华等1996）。除少数外，绝大多数乳酸菌是正常人、畜肠道中极为重要的生理菌群，担负着人、畜机体多种重要的生理功能，具有维持人体中微生态平衡的作用，与机体健康息息相关。由于乳酸菌特殊的生理条件，在厌氧环境下发酵产酸造成环境pH值下降，对一些腐败菌与病原菌的生长起到抑制作用。并且，乳酸菌在代谢过程中还会产生有机酸、H2O2、双乙酰（Lindgren,S.W.et al,1990）及其产生的抑菌活性代谢产物细菌素（细菌素是某些细菌产生的具有抗菌活性的多肽、蛋白质或蛋白质复合物（Klaenhammer T R，1998），某些细菌通过核糖体机制产生的一类具有抑菌生物活性的蛋白质，大多数细菌只对亲缘关系较近的细菌有毒害作用，产生菌对其产生的细菌素具有自身免疫性（Abee T,Krockel L,1995）正因为这些物质的存在，阻止了病原菌的定植，调节机体的免疫系统、降低机体胆固醇水平和改善机体对乳糖的不适应性的功能（Petronella J Looijesteijn, Ingeborg C Boels,1999）。
&&&& 乳酸菌从形态上一般分为球菌和杆菌，革兰氏阳性，厌氧或兼性厌氧，以单糖（葡萄糖、果糖、半乳糖）和二糖（蔗糖、麦芽糖、乳糖）为碳源和能源，代谢产物主要是乳酸。人们利用乳酸菌发酵制作泡菜、酸菜、乳酪、酸奶等食品。目前，乳酸菌已广泛应用于食品工业、农业和医药等与人类生活密切相关的重要领域。
国内外泡菜生产研究现状
国内泡菜发展现状
&&& 蔬菜泡制是我国一种古老的蔬菜加工保藏方法。大约在3000年前，中国就有了酱菜制作工艺（郑云溶,2002）。根据中国最早的诗集《诗经》记载，中国泡菜的雏形应该是“菹”字。目前，国内泡菜主要集中在西南和中南各省 [邓开荣,2001]，尤以四川成都泡菜为代表，以其独有的风味闻名于世。驰名中外的川菜中很多调料必需四川泡菜，诸如酸菜鱼、鱼香茄子、鱼香肉丝等。四川泡菜以其酸鲜纯正、脆嫩芳香、清爽可口的特性享有盛誉，是川菜中风味小菜的组成部分，吸引着众多食客。由于成都位于川西平原腹地，温暖潮湿，四季分明的气候条件既有利于乳酸发酵，又有利于四季蔬菜常青，蔬菜资源极为丰富。仅成都周边的泡菜厂就在1000家以上。目前，成都泡菜已出口到美国、加拿大、日本、尼伯尔等多个国家和地区。但是，我国生产的泡菜，市场销售额还不足10亿元，出口总额约为500万美元，仅占国际泡菜市场总量的3%（陈仲翔，董英,2004）。
&&& 国内众多泡菜生产企业中多采用传统自然发酵工艺，其规模小，产量低，为泡菜大规模生产带来诸多弊端。如发酵周期相对较长，生产力低下；卫生条件达不到国家安全标准；发酵质量不稳定，不利于工厂化、规模化及标准生产；亚硝酸盐、食盐含量高，食用安全性差等。为了解决以上问题，国内学者相继对泡菜中乳酸菌区系和泡菜中乳酸菌的分离、菌种特性进行研究，以及对乳酸菌纯菌种发酵的研究，并取得了较好的效果。杨瑞鹏等人（杨瑞鹏，赵学慧,1991）进行了酸泡菜发酵过程中乳酸菌区系的研究；吴红艳等人（吴艳红等,1997）利用甘蓝、胡萝卜等原料，接种肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、短乳杆菌进行发酵，进行了菌种配比、菌种添加量、发酵时间及主要工艺参数；毕金峰等人（毕金峰，刘长江等,2000）从自然发酵酸菜汁中分离鉴定乳酸菌，并进行发酵剂的筛选；林燕文、黄均红等人（林燕文，黄君红,2001）在含高浓度的泡菜中添加维生素或氨基酸，检测乳酸菌含量的变化，发现添加适量的维生素或氨基酸可以提高乳酸菌的含量，维持高含菌量的时间也较长；熊晓辉等人（熊晓辉，王晓飞等,2004）从泡菜汁中分离乳酸菌，筛选出了3株产酸量较高、生长良好的菌株，并发现以其为纯培养发酵剂制备萝卜泡菜，质量优于自然发酵产品；叶淑红等人（叶淑红，何连芳,2004）将植物乳杆菌应用在制作泡菜中，发现人工接种从发酵周期、乳酸产量、感官评定等各个方面都明显优于自然发酵，既适合家庭制作，又适合工业化大批量生产；沈国华等（沈国华,2002）进行了采用植物乳杆菌或干酪乳杆菌单独或以1：1比例混合的蔬菜接种发酵；毕金峰等人（毕金峰等,2000）利用明串珠菌和乳酸杆菌进行复配取得了较好效果；罗云波（罗云波,2001）认为植物乳杆菌、发酵乳杆菌、肠膜明串珠菌以5：3：2较为合适；蒋和体（蒋和体,1994）则认为以上的比例为3：1：1比较合适。并且除了为数不多的具备小规模工业化生产能力外，其余均属零星、分散的作坊式生产。
国外泡菜发展现状
&&&& 国外泡菜主要集中在韩国和日本，尤以韩国泡菜最为出名。早在1300年前韩半岛三国时代，泡菜由中国传到韩国，并结合韩民族的饮食文化，发展成为今日的韩国泡菜。欧洲泡菜也是于17世纪由我国引入，其发酵蔬菜制品在1985年为51万吨橄榄、22万吨卷心菜和4.5万吨腌黄瓜（杨洁彬，郭兴华，1996）。1999年韩国国内泡菜市场产值约为16.7亿美元（钟龙往，2005）。1998年日本泡菜生产量达到18万多吨，已形成了1000亿日元的巨大市场。目前，全球泡菜份额中，日韩泡菜在国际市场已占据了95%。随着泡菜的不断发展，国外学者对泡菜的研究也越来越深入。在韩国尤为明显，2000年还在青州大学增设了泡菜专业，为韩国培养了第一批专门研究泡菜的人才[李幼筠,2001]。
&&&& Hennebery（Henebery,W,1926）首先在其《细菌发酵手册》中提到了乳酸杆菌属和片球菌属的某些种类。Pederson（Pederson,C.S,1930）在1930年研究了泡卷心菜(Sauerkraut)中的微生物，首次提出了明串珠菌启动蔬菜的乳酸发酵过程。Dong Gwan Kim 等人（Dong Gwan Kim,1994）考察了泡菜发酵过程中卷心菜中还原糖的变化；Mee Kyung Kim 等人（MEE Kyung Kim,1994） 研究了泡菜发酵过程中，卷心菜颜色变化与pH之间的关系。90年代后期，研究重点转向了泡菜中菌种的分离鉴定及其特性的研究，同时采用不同原料开发具有保健功能的泡菜。研究深度比90年代前期更加深入。Jong Hyen Kim 等人（Jong Hyen Kim,2002）研究了泡菜对小鼠大脑中抗氧化酶活性和自由基产生的影响，研究表明，泡菜，尤其是含有芥菜叶的泡菜有延迟衰老的作用。Heui Dong Park 等人（Heui Dong Park,2001）研究了从泡菜中分离出来的Lactobacillus plantarum的抗突变活性。需要进一步认识和挖掘泡菜的营养价值和功能特性。
乳酸菌在泡菜加工中的作用
提高蔬菜的营养价值和风味
&&&& 乳酸菌虽然在代谢过程中消耗部分的纤维素，但在泡菜发酵过程中能够利用蔬菜原料的可溶性物质代谢合成叶酸等B族维生素，有机酸使pH值降低，增加肠内维生素B1、B6和B12的稳定性，从而提高了发酵制品的营养价值（杨春哲，冉艳红，2000；F.P.Niinivara ，1964）。并且，乳酸菌不具备分解纤维素和水解蛋白质的酶系统，其在发酵过程中既不会破坏植物细胞的组织，也不会降低蔬菜原料的营养价值（张华，1997）。蔬菜在发酵过程中，由于蛋白质的分解作用，提高了游离氨基酸的含量和蛋白质的消化率，同时，形成了酸类、醇类、碳氢化合物、杂环化合物、游离氨基酸和核苷酸等风味物质，使蔬菜制品的营养价值和风味都得到了改善（潘润淑，1997）。
产生乳酸菌素有效抑制腐败菌，延长食品的保质期
&&&&& 由于乳酸菌特殊的生理条件，在代谢过程中能产生有机酸、H2O2、CO2、双乙酰、细菌素(Bacteriocins)等多种天然抑菌物质（孔健,1995），这些物质协同乳酸菌所产生的乳酸菌素来抑制食品中腐败菌和致病菌的生长，具有维持肠道内微生态平衡，提高机体免疫力，促进营养物质吸收等多种功能可以有效地抑制食品中革兰氏阳性菌的生长，如微球菌、分枝杆菌、棒杆菌、葡萄球菌和利斯特氏菌等，对于梭状芽孢杆菌也有很好的抑制作用，能有效阻止孢子的萌芽和毒素的生长。而细菌素本身能够被人体消化道分泌的酶降解，具有抗菌性强、安全无毒、水溶性好、热稳定性好等优点，作为一种生物防腐剂已经越来越受到人们的重视。不同的乳酸菌所产生的乳酸菌素是不同的，不同的乳酸菌素具有不同的抑菌谱和抑菌活性，有的乳酸菌素不具有抑菌活性。因此，寻找广谱、高效、低毒天然食品防腐剂是目前食品科学研究中的热点之一。许多乳酸菌在食品发酵方面具有重要的作用，抑制一些附着在食品表面，使食品酸败或腐败的微生物（Ray, B. and M. Daesche,1992，Stiles, K. A ,1991）。
&&&& 国外对乳酸菌细菌素的研究比较早，报道的文献资料很多（ Klaenhammer T R,1993; Abee T,1995; Jack R W,1995; Nes I F,Diep D B ,1996; Stiles M E ,1996; Helander I M ,1997）。而国内则起步较晚，除了nisin的研究外（环连栋，陈秀珠,1993; 孔健，马桂荣，1995; 陈秀珠，何松,1996; 刘稳，马桂荣,1996），很少见到有关其它乳酸菌细菌素的报道。到目前为止已描述了40多种乳酸菌细菌素，它们是一群复杂的拮抗物质。近年来随着对乳酸菌细菌素研究不断关注，开发乳酸菌细菌素作为新型的天然食品防腐剂和饲料添加剂已作为研究热点，并将应用于工业中，具有代表性的例子是研究最早、最成熟的乳酸链球菌素（Nisin）已广泛的应用于食品防腐中，尤其是日常快销产品中（Hugenholtz, J ,1991; Hurst,A ,1981; Molitor, E. and h.-G.Sahl ,1991）如牛奶制品（包括鲜牛奶、奶粉、酸奶、奶酪等）、罐头食品、饮料、肉类食品、鱼类以及酒精饮料等等（彭沈军，李东，1995）。
增加蔬菜的医疗保健作用
&&&& 乳酸菌是人体胃肠道的益生菌群（彭沈军，李东，1995）。通过其自身及其代谢产物和与其它细菌之间的相互作用，调整菌群之间的关系，维持人体肠道的微生态平衡，增强机体的免疫力，降低胆固醇水平，缓解乳糖不耐症及抑制肿瘤细胞的形成等（顾瑞霞，谢继志，1995）。因此，食用乳酸菌发酵的蔬菜制品，人体除了吸收蔬菜的营养成分外，还摄入了一些乳酸菌能耐受胃部不利的酸性条件而到达肠道如嗜酸乳杆菌，这些菌能抑制一些结肠中的细菌酶，特别是那些能促进致癌物前体向致癌物转化的粪便酶。另外，致癌作用是通过具有致癌物诱导动物细胞突变开始的，而一些乳酸菌可抑制动物细胞的突变（韩俊华，盛晓甘，2002）。
乳酸菌抑制泡菜中亚硝酸盐的形成
&&&& 蔬菜是一种富集硝酸盐的植物性食品（Eichholzer M,Gutzuiler F，1998），当人们食用含有硝酸盐的蔬菜后，硝酸盐经口腔细菌的作用，还原为亚硝酸盐（White.J.W，1975）（亚硝酸盐是强致癌物亚硝胺的前体，是影响泡菜品质的重要原因之一）。蔬菜经过腌制发酵过程中，有害微生物将蔬菜中的硝酸盐还原为亚硝酸盐及某些杂菌可将硝酸盐转化为亚硝酸盐。当人体摄入亚硝酸盐后，亚硝酸盐能和胃中的含氮化合物结合成具有致癌性的亚硝胺，对人体健康产生危害（刘青梅，杨性民，2001；罗晓梅,朱波，2003）。因此，泡菜中亚硝酸盐的含量逐渐引起人们的重视。近年来，众多学者（郭晓红，杨洁彬，1989；杨性民，刘青梅，2003）采用人工接种乳酸菌技术缩短蔬菜制品的发酵周期，改善发酵蔬菜的品质，显著降低亚硝酸盐生成（蒋和体，1994）。
&&&& 泡菜中的乳酸和乳酸菌对人体的健康有益，乳酸菌在乳酸发酵的冷加工方式对蔬菜营养成分，色香味的保持极为有利，产品既有良好的感官品质，又节约能源。同时在发酵过程中，乳酸菌产生大量的乳酸，使环境pH降低，在H+的作用下，有利于NO2还原成NO，从而降低亚硝酸盐的残留量（蒋和体，1994）。同时，由于硝酸还原酶的适宜pH值为7~7.5，随着酸度增加，酶活性降低，甚至无活性，促使亚硝酸盐降解，减少亚硝酸盐与二级胺反应生成致癌物质――亚硝胺，提高了食品的安全性和货架期。
&&&&& 我国泡菜生产主要集中在四川地区，尤其是成都平原，这一地区由于其独特的地理环境和气候条件，造成了该地区有着丰富的自然资源，由于成都位于川西平原腹地，温暖潮湿，四季分明的气候条件既有利于乳酸发酵，又有利于四季蔬菜常青，蔬菜资源极为丰富。为该地区泡菜生产提供了丰富的物质条件，并且其适宜的气候条件为附生于蔬菜表面的微生物提供良好的栖息之所。
&&&&& 四川泡菜以其酸鲜纯正、脆嫩芳香、清爽可口的特性享有盛誉。但是，泡菜的生产是一个十分复杂的微生物学发酵过程，同时伴随着复杂的生物化学变化和物理变化，泡菜在很多方面仍然是“知其然不知其所以然”，在发酵过程中还存在许多未知的领域，导致泡菜在生产过程中出现了一系列问题，限制了泡菜行业的进一步发展。长期以来，泡菜的生产方式大都采用传统的自然发酵，其缺点是泡菜汁中发酵的底物浓度较低，乳酸发酵缓慢，发酵周期较长，酸味较弱，并且受环境因子影响也很大，使产品质量不稳定，同时亚硝酸含量在很大程度上得不到有效的控制。近年来，对泡菜的研究不断深入，由传统的自然发酵方式逐渐转变为人工接种发酵方式，但采用的菌种比较单一，发酵出来的泡菜风味失去了自然发酵中独特的风味，这可能与泡菜中存在多种乳酸菌有着密切的关系。因此，本研究以四川地区自然发酵泡菜汁为材料，分离获得的乳酸菌菌种，采用形态、生理生化鉴定和数值分类的方法，揭示自然发酵泡菜中乳酸菌资源的种群多样性和表型多样性，并从分离的乳酸菌菌种中筛选细菌素产生菌，不仅对革兰氏阳性细菌有抑制作用，而且对革兰氏阴性细菌也有抑制作用，为进一步筛选优良发酵剂菌种奠定基础，为今后工业化人工接种乳酸菌于泡菜发酵，开发，医药利用提供乳酸菌资源和理论基础。
材料和方法
&&&& 从成都、乐山、泸州、峨眉山、宜宾、内江、雅安、西昌、汶川、双流、遂宁、金堂、隆昌、贵阳、重庆等15个市县区采集自然发酵泡菜汁样品34份。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&& &表1& 样品来源及特点
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& Table 1 the source and characteristic of samples
分离乳酸菌数
杆菌&&&& 球菌
雅安雨城区
萝卜、豇豆、青菜
雅安雨城区
萝卜、青菜
雅安雨城区
青菜、莲花白、萝卜
雅安雨城区
雅安雨城区
莲花白、萝卜、豇豆
雅安雨城区
雅安雨城区
雅安雨城区
成都武侯区
雅安雨城区
成都金牛区
宜宾翠屏区
峨眉山市区
雅安雨城区
成都青羊区
雅安雨城区
阿坝汶川县
泸州龙马潭
成都武侯区
重庆万州区
实验室泡制
萝卜、青菜、豇豆
萝卜，莲花白
莲花白、豇豆
青菜、豇豆
豇豆、萝卜、白菜、黄瓜
蒜苔、萝卜、芹菜
豇豆、萝卜、蒜苔、娃娃菜
豇豆、萝卜
青菜、豇豆、萝卜
萝卜、白菜
青菜、豇豆、萝卜
青菜、豇豆
萝卜，莲花白
豇豆、萝卜、白菜、黄瓜
仔姜、木瓜、黄瓜、萝卜、苦耳瓜
蒜、葱头、青菜、豇豆
豇豆、莴笋
萝卜、木瓜
萝卜、豇豆、青菜、芹菜、洋姜
酸菜、豇豆
青菜、豇豆
注：在所有泡菜中添加的调料有：姜，辣椒，大蒜。
（1）分离的纯菌株
（2）参考菌株：
B1德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）
B2德氏乳杆菌德氏亚种（L. delbrueckii subsp. delbrueckii）
B3噬酸乳杆菌（L.acidophilus）
B4植物乳杆菌（L.plantarum）
B5肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranium）
B6双发酵乳杆菌（L.bifermentans）
B7干酪乳杆菌干酪亚种（L.casei subsp.casei）
B8乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactic subsp. lactis）
B9瑞士乳杆菌（L.helveticus）
B11发酵乳杆菌（L.fermentium）
B12 棒状乳杆菌棒状亚种(L.coryniformis)
B13 干酪乳杆菌干酪亚种（L.casei subsp.casei）
B14 短乳杆菌((L.brevis)
B15 布氏乳杆菌(L.buchneri)
B16植物乳杆菌（L.plantarum）
菌株B1-B16购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
大肠杆菌（Escherichia coli）&&&&& 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
菌种来源四川农业大学微生物实验室。
样品的采集
&&& 采集自然发酵泡菜汁于灭菌瓶中，放入4℃冰箱中保存备用。
主料：市售萝卜
辅料：大蒜，姜，花椒，辣椒，食盐
泡菜的制作
&&&&& 将萝卜洗净，切成小块（带皮），每个小泡菜坛中分别随机称取200g萝卜，定量加入2g大蒜、2g姜、0.5g花椒、0.5g辣椒，230mL凉开水、8%食盐，装于小泡菜坛中。
菌种：所有分离、纯化的乳酸菌种
供试培养基
&&&&& 乳杆菌属分离用SL或MRS培养基（凌代文，东秀珠，1999），乳球菌属分离用Elliker培养基（凌代文，东秀珠，1999），链球菌属分离用基础培养基（凌代文，东秀珠，1999），明串珠菌属分离用蔗糖硫胺培养基（陈天寿，1995），肠球菌属分离用KF培养基（M.J.小佩尔扎，R.D.里德，E.C.S.詹，1984），纯化用MRS培养基（凌代文，东秀珠，1999）。
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌用牛肉膏蛋白胨培养基
革兰氏染色用试剂：草酸铵结晶紫染色液、革兰氏碘液、95%酒精、石炭酸复红溶液
亚硝酸盐测定试剂： 盐酸萘乙二胺； 对氨基苯磺酸；亚硝酸钠；硫酸锌；氯化铵；氢氧化钠
过氧化氢酶测定试剂：0.01mol/L的过氧化氢溶液；1.8mol/L的硫酸溶液；10%钼酸铵溶液；
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 1% 的淀粉溶液；20%的碘化钾溶液
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质试剂：考马斯亮蓝G-250；95%酒精；85%的磷酸；
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 结晶牛血清白&& 蛋白
实验室分离纯化
挑取一环泡菜汁，搅拌接种
于30-40℃琼脂柱培养基中，
37℃培养24-72h
挑取单个菌落，点接接种于
含BCP（1.6%）的双层平板上，
37℃培养24-72h
挑取产生黄色色素的单个菌落，
划线接种于含BCP（1.6%）的
双层平板上， 37℃培养
挑取产生黄色色素的单个菌落，
接入MRS液体培养基中，
37℃培养24-72h
革兰氏染色涂片镜检，
阳性纯菌株
穿刺接种于含1%的CaCO3MRS
半固体培养基中, 37℃培养24-72h
&4℃冰箱保存备用，另收集对数生长期菌体保存于-70℃
&&&&& 用NTSYSpc21将实验数据转化为计算机语言，用NTSYSpc21软件进行聚类分析。
2.3.2.1性状编码
&&&& 处理数据之前，必须先将测定的性状转化为计算机语言，通常采用三种不同的编码方法（李季抡，1995）。
（1）定性两态性状
&&&& 可以用是否来表示性状，如对一碳源或氮源的利用情况，或对一化学药物的抗性等，结果记录时阳性用“+”，阴性用“-”转化为计算机语言时为“1”和“0”。
（2）定量多态性状
&&& 也称有序多态性状，可依次按数量大小有序排列。如耐盐性、对不同浓度的同种抗生素的抗性等性状。这类性状采用加权分解成多个两态性状来进行编码。
定量多态性状的编码
（3）定性多态性状
&&&&& 又称无序多态性状，不能按一种明确次序进行。这类性状是通过转化为多个二态性来处理。
定性多态性状的编码
2.3.2.2相似性计算
&&&& 采用Sokul和Nichener(1958)的简单匹配系数(Simple matching coeffcient)来比较菌株间的相似性&& 计算公式：Ssm=(a+d)/(a+b+c+d-NC)
其中 “a”表示被比较的菌株A和B都是“+”的结果的编码特征个数
“b”表示A为“+”结果，B为“-”结果的编码特征个数
“c”表示A为“-”结果，B为“+”结果的编码特征个数
“d”表示菌株A和B都是“-”的结果的编码特征个数
“NC”表示资料缺失不参与比较的特征个数
2.3.2.3聚类方法
&&&& 常用平均连锁法（UPGMA）。平均连锁法又称类平均法，它既无全连锁法的空间扩张性质，也无单连锁法的空间收缩性质。该法属于系统聚类法，它将众多样本逐渐归群，最后归为一个大类。
平均连锁法的原则是把一个样本内的每一个元素到另一个样本内的每一个元素的距离（通过相似性来表示）的总和对所有元素的均值作为两个样本间的距离，并据此均值由大到小进行逐级归类，归类结果通常以树状图谱的方式表示。
&&& 生理生化试验均设3个重复及阴性和阳性对照（陈强，2004；胡清华，2002）。除温度试验外，均在37℃培养。
唯一碳源利用（编码特征1-19）
&&&& 试验中以甘露醇、D-海藻糖、D-山梨醇、木糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、葡萄糖酸钠、棉籽糖、纤维二糖、D-阿拉伯糖、D-核糖、鼠李糖、淀粉、甘油、肌醇、马尿酸钠等18种含碳化合物作为唯一碳源，根据要求不同在PY基础培养液中浓度分别为1%和0.5%。结果用BTB―MR指示剂检测（凌代文，东秀珠，1999）。葡萄糖发酵同时检测产酸产气的情况（M.J.小佩尔扎，R.D.里德，E.C.S.詹，1984）。
过氧化氢酶试验（编码特征20）
&&&& 将供试菌株接种于MRS培养液中，37℃培养18h，用接种环挑取一环涂于干净的载玻片上，放置约20min后，在其上加一滴3%的H2O2，若有气泡产生则为阳性反应，无气泡为阴性反应（凌代文，东秀珠，1999）。
氧化酶试验（编码特征21）
&&& 用1%四甲基对苯二胺盐酸浸湿新华滤纸，置于培养皿中，然后用灭菌竹签挑取供试菌在滤纸上划线，10s内若划线部分变为紫色者为阳性反应，不变色者为阴性（东秀珠，蔡妙英，2001）。
石蕊牛乳试验（编码特征22-27）
&&& 将2.5%的石蕊水溶液与脱脂乳按4：100（v/v）的比例混合，使牛乳呈丁香花紫色；分装试管，110℃灭菌20min。接种供试菌，37℃培养，持续观察14d，记录结果（东秀珠，蔡妙英，2001；赵斌，何绍江，2002）。 细菌对牛奶的作用有以下几种情况：
（1）产酸――细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红。
（2）产碱――细菌分解酪蛋白产生碱性物质，使石蕊变蓝。
（3）胨化――细菌产生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶变得比较澄清。
（4）酸凝固――细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红，酸度很高时，可使牛奶凝固。
（5）凝乳酶凝固――有些细菌能产生凝乳酶，使牛奶中的酪蛋白凝固，此时石蕊常呈蓝色或不变色。
（6）还原――细菌生长旺盛，使培养基氧化还原电位降低，因而石蕊还原褪色。
&0.1%美兰牛乳试验（编码特征28-29）
& &&&将脱脂乳分装试管，110℃灭菌20min。接种供试菌，37℃培养3天后加入1滴0.1%的美蓝溶液，蓝色褪去者为美蓝还原阳性，蓝色不褪去者为阴性（张丽萍，艾玉琴，杨焕民，1995；沈萍，范秀容，1999）。
耐酸碱试验（编码特征30-35）
&&& 本试验测定了供试菌株对酸碱的耐受性。先将MRS液体培养基灭菌后用无菌HCl和NaOH将培养基的pH调至pH3.0、 pH 4.0、 pH 4.5、 pH8.0、 pH 9.2、 pH 9.6，以pH6.4的液体做阳性对照。接种、培养、观察和记录结果，与阳性对照同样浑浊的记为阳性，否则为阴性（凌代文，东秀珠，1999）。
生长温度范围试验（编码特征36-41）
&& 选择10℃、15℃、18℃、45℃、50℃、60℃（30min）等6种不同温度范围的反应，MRS液体培养基培养，结果用接种菌株于37℃培养为阳性对照（凌代文，东秀珠，1999）。
耐盐性测定（编码特征42-47）
&& &在3%、4%、6.5%、8%、12%、15%等6种不同NaCl浓度范围的反应在MRS液体培养基培养，结果以不含NaCl的MRS液体培养基作对照（凌代文，东秀珠，1999）。
硝酸盐还原反应（编码特征48）
&& &将硝酸盐还原液体培养基分装试管，8mL/管，37℃培养48h，另保留一支不接种硝酸盐培养基作为对照。检查方法如下：在比色皿中，加入一滴菌液，再加Griess试剂A、B液各一滴，如出现橙色或红色为硝酸盐还原阳性；如无橙色或红色出现，则再加一滴二苯胺试剂进一步检查，若呈现蓝色反应，则为阴性结果，不呈现蓝色，则为阳性结果（赵斌，何绍江，2002）。
七叶苷水解（编码特征49）
&&& 在PY基础培养基中加入七叶苷，其浓度为5g/L，分装灭菌，培养2d后取少许培养液于比色皿中，同时以未接种的七叶苷培养液为对照，分别滴加柠檬酸铁试剂，如为黑色，则为阳性反应，不显色，为阴性（凌代文，东秀珠，1999）。
联苯胺反应试验（编码特征50）
&&& 将供试菌株接种于含联苯胺指示剂的半固体琼脂中，37℃培养，观察菌株还原联苯胺情况（李季伦等，1985）。
柠檬酸盐利用试验（编码特征51）
&&&&& 将供试菌株接种于柠檬酸盐培养基（加入溴麝香草酚蓝）中，37℃培养2d，观察记录结果。斜面培养基呈蓝色的为阳性，不变色为阴性（陈天寿，1995）。
葡聚糖产生试验（编码特征52）
&&&&& 将供试菌株接种于含10%蔗糖的MRS固体培养基平板上，25℃培养2-4d。如平板培养物形成粘稠状菌苔，表明葡聚糖产生，为阳性反应；反之，为阴性反应（凌代文，东秀珠，1999）。
吲哚产生试验（编码特征53）
&&&& &将供试菌株接种于产吲哚的培养液中，37℃培养24h，向试管中加入吲哚指示剂，观察结果。若培养液上层出现玫瑰红色，说明产生了吲哚，为阳性，若没有玫瑰红色出现，则向其中加入乙醚约1mL，震荡混匀，静置片刻，待乙醚浮于培养液上面时，沿管壁慢慢加入吲哚指示剂10滴，此时若乙醚层出现玫瑰红色，同样说明有吲哚产生，为阳性，反之为阴性（东秀珠，蔡妙英，2001；赵斌，何绍江，2002）。
硫化氢产生（编码特征54）
&&&&& 将供试菌株接种于含半胱氨酸的培养液中，用无菌镊子夹取乙酸铅纸条悬挂于接种管中，纸条下端接近培养基表面而不接触液面，上端用棉塞塞紧，同时在未接种的试管培养基上也悬挂纸条，作为对照。置于适温培养，观察比较，纸条变黑者为阳性，反之，为阴性（凌代文，东秀珠，1999）。
明胶液化试验（编码特征55）
&&&&& 将供试菌株接种于含1.2明胶的基础培养基中，以不接菌明胶培养基作对照，适温培养，4d后取出置于低于20℃的环境，等空白对照凝固后观察。若培养基呈流动状或表面向下凹陷为阳性，不凝固者，放回温箱继续培养至7d再观察，直至30d，仍然不液化则为阴性反应（凌代文，东秀珠，1999）。
V-P反应（编码特征56）
&&&&& 将供试菌株接种于MRS培养液中，37℃培养48h，取1mL于无菌试管中，在其中加入0.6mL试剂A和试剂B（不加盖），摇床振荡30min，显示红色为阳性，反之为阴性（凌代文，东秀珠，1999）。
试剂A:a-萘酚5.0 g，95%乙醇100mL
试剂B：KOH 80g，肌醇（Creatine）0.6g，蒸馏水 200mL。
甲基红（编码特征57）
&&&& 接种供试菌株于蛋白胨液体培养基中，每次重复2次，适温培养2、6d，观察结果。在培养液中加入一滴甲基红试剂，红色为甲基红试验阳性反应，黄色为阴性反应（因甲基红变色范围4.4红至6.6黄）（东秀珠，蔡妙英，2001）。
试剂：甲基红&&&&&&&&&&&&&&& 0.1g
&&&&& 95%乙醇&&&&&&&&&&&&& 300mL
&&&&& 蒸馏水&&&&&&&&&&&&&&& 200mL
苯丙氨酸脱氨酶测定（编码特征58）
&&&&&将供试菌株接入苯丙氨酸培养基内。28℃培养24h后，在培养基上滴加4-5滴10%Fecl3溶液，出现蓝绿色者为阳性，否则为阴性反应（张纪中，1990）。
纤维素分解试验（编码特征59）
&&&& 将基础培养基分装试管，在培养基中浸泡一条优质滤纸。将供试菌接种于该基础培养基中，37℃培养1-4周，观察结果。将滤纸条分解成一团纤维或将滤纸条折断或变薄者为阳性，滤纸条无变化者为阴性（东秀珠，蔡妙英，2001）。
脲酶测定（编码特征60）
&&&& 将尿素灭菌后添加到PY基础培养液内，将供试菌接种于该培养基内，同时接种未加尿素浓缩液的PY基础培养基中作对照。适温培养2-5d，观察结果。检测pH值，将酚红指示剂滴入培养液中，PY尿素培养液显红色，为阳性反应。如果其中培养液与对照一样，不变红色，为阴性[凌代文，东秀珠，1999]。
精氨酸产氨试验（编码特征61）
&&&& 将供试菌株接种于含精氨酸的PY基础培养液中，同时接种不含精氨酸的PY培养液做对照，37℃培养3d，取少量培养液于比色皿中，加奈氏试剂数滴，若出现橙黄色或黄褐色沉淀，且明显强于对照，为阳性反应；反之为阴性反应（凌代文，东秀珠，1999）。
精氨酸水解试验（编码特征62）
&&&& 接种1-2滴培养过夜的菌液在特殊培养基内，并在其上层加盖无菌的石蜡矿物油。放置在37℃下，培养72h。观察结果，接种和培养的试管培养基转变成黄色，指示葡萄糖产酸，为阴性反应。培养基内pH指示剂显示紫色，表明精氨酸经细菌酶水解，释放有碱性产物，是阳性反应（凌代文，东秀珠，1999）。
丙二酸利用试验（编码特征63）
&&&& 将供试幼龄菌种接种于丙二酸培养液（加入溴百里酚蓝）中，另接种未加丙二酸的作空白对照。适温培养1-2d，培养液由绿变蓝者为阳性；培养基不变色者为阴性（赵斌，何绍江，2002）。
酪素水解试验（酪蛋白水解）（编码特征64）
&&&& 牛奶平板的制备：取5克脱脂奶粉加入50mL蒸馏水，另称1.5克琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷却至45-50℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥，然后将菌种点接在平板上，每皿可点接3-5株菌。适温培养1d、3d、5d，记录菌落周围和下面酪素是否被分解而呈透明（张纪中，1990）。
药敏试验（编码特征65-72）
&&&&& 采用纸片法，选择青霉素、链霉素、头孢霉素、庆大霉素等四种抗生素，分别取二个梯度为：0.25mg/mL， 0.50mg/mL。供试菌株接种于双层平板，药敏纸片贴于平板夹层，37℃培养2d，观察记录抑菌圈的大小（以纸片边缘量起），≤5nm,记为阴性，≥6nm记为阳性（凌代文，东秀珠，1999；东秀珠，蔡妙英，2001）。
&&&&& 用NTSYSpc21将实验数据转化为计算机语言，采用平均连锁法（UPGMA），用NTSYSpc21软件进行聚类分析。
乳酸菌属种的鉴定
&&&& 革兰氏染色涂片镜检阳性、过氧化氢酶阴性、含溴甲酚紫平板上形成黄色菌落的菌株初步判定为乳酸菌。依据数值分类试验中测定性状结果，结果与《伯杰细菌鉴定手册》（R.E.布坎南，N.E.吉本斯，1984）、《常见细菌系统鉴定手册》（东秀株，蔡妙英，2001）、《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》（Peter H.A.Sneath，1984）《乳酸菌分类鉴定及实验方法》（凌代文，东秀珠，1999）对照进行判别。
乳酸菌产细菌素的筛选
2.3.6.1 指示菌株
&&&& 选取不同类型的代表菌―革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌，以测定所选育的乳酸菌种的抗菌特性，选出具有广谱、高效抑菌活性的乳酸菌。
2.3.6.2 方法
2.3.6.3 产抑菌活性物质乳酸菌的筛选试验
（1） 指示菌的培养及菌悬液的制备
&&&& 整个实验期间，将大肠杆菌（Escherichia coli），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面，每两周继代一次，并保存于4℃冰箱。使用前分别置于上述液体培养基中于37℃恒温箱中，增殖2次，每次培养18-24h。
（2） 供试菌株―乳酸菌的培养及其代谢产物的收集
&&&& 乳酸菌的培养：在无菌操作的条件下，把供试乳酸菌接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h，把发酵液在4℃、4000r/min的条件下，离心30 min，除去沉淀的菌体细胞，取上清夜，用NaOH调上清夜的pH值到6.0。
（3）细菌素活性较高菌株的筛选：采用牛津杯法检测
&&&&& 牛津杯法：在培养皿中加入20mL灭菌牛肉膏固体培养基，待凝固后，用灭菌吸管分别吸取0.1mL指示菌液涂布于培养皿中，在每个培养皿内等距离放置牛津杯4个，每个牛津杯加入200&L上清夜。于37℃培养24h后观察平皿，观察在牛津杯周围是否有明显的抑菌圈。
（4）产细菌素菌株的确定：采用逐步排除干扰的方法
① 中和法排除有机酸的影响
&&&&& 发酵液对指示菌的抑制作用，可能是细菌素，也可能是有机酸。为排除有机酸的干扰，将乳酸菌发酵液pH值用NaOH调至pH=6.0后采用牛津杯法对指示菌进行抑菌能力的测定。选择抑菌圈差值较大的发酵液产生菌作为继续研究的对象。
② 过氧化氢酶法排除过氧化氢的影响
&&&&& 将乳酸菌发酵液置于80℃水浴中加热10min，然后采用牛津杯法测定发酵液的抑菌活性。由于过氧化氢不稳定，温度升高后容易分解，因此通过加热可去处发酵液中的过氧化氢（潘亚萍等，1995）。
③ 考马斯亮蓝G-250法检测附加过程中蛋白质含量的变化。
&&&&& 准确加入乳酸菌发酵液0.1mL于试管中，再分别加入0.9mL蒸馏水和5mL考马斯亮蓝G-250试剂，放置10min，在595nm波长下比色测定其吸光度值（鲁子贤，1985）。
人工接种泡菜亚硝酸盐的测定
2.3.7.1 菌悬液制备
&&&& 将供试乳酸菌接种于液体培养基中活化，然后转入液体管中进行扩大培养（37℃，48h），测各管的OD620值。以上菌种培养，均在无菌条件下操作。
2.3.7.2接种发酵
&&&&& 分别在OD620值一致的液体管中取1mL菌悬液接种于泡菜坛中。然后均在室温条件下进行发酵，培养1d后，定时取培养液，测定亚硝酸盐的含量及pH值，每天1次,连续测定6d。
亚硝酸盐含量及 pH测定
2.3.8.1 亚硝酸盐(以NaNO2记)的测定& 盐酸萘乙二胺法（张庆芳，迟乃玉，郑艳等，2002）
&&&&& 国家标准GB/T中的格里斯试剂比色法，首先绘制NO2-标准液的曲线图，再对样品进行比色，记录其吸光度，再查出对应的NO2-浓度（黄伟坤等，1996）
2.3.8.2 &pH值的测定& 玻璃电极法。
结果与分析
分离纯化结果
&&&&& 从35份样品中分离得到116株菌株，其中杆菌94株，球菌22株，经革兰氏染色和过氧化氢酶反应，革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，且在含溴甲酚紫的平板上都是黄色的菌落，初步鉴定为乳酸菌。
数值分类结果
&&&& 数值分类是分类研究中常用的初步分群方法之一，能从获得供试菌株的表型性状和鉴别特征，又能在分类结果的基础上，以75%相似水平作为初步的分群标准（Sneath,P.H.A，1984）。而乳酸菌利用数值聚类来进行分类还是一个较新的方法。本试验对供试菌株和参比菌株进行了72项生理生化性状测定。
&&&& 在所有72项表型性状中，除去22项全相同性状（表2），对余下的50个性状采用NTSYSpc21软件进行聚类分析。用平均连锁法聚类，得到供试菌株的数值分类聚类树状图（图1，图2）。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 表2 数值分类全同性状表
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &Table 2 the schedule of identical characteristics
全部为阳性反应“+”的性状
全部为阴性反应“-”的性状
产酸、酸凝、还原
pH4.5& pH8.0
吲哚、硝酸还原、氧化氢、苯丙氨酸、硫化氢、过氧化氢、酪蛋白、明胶、甲基红、联苯胺、纤维素
产碱、胨化、酶凝
数值分类结果及各独立表观群的基本特征描述
3.2.1.1 乳酸球菌数值分类结果及各表观群的描述
&&&&&& 从图1中可以看出，所有的乳酸球菌供试菌在61%相似性水平上被分为两个大的分支，并且在63%相似水平上有将其中一个大的分支又分为两个分支。因此，实际可分为3个分支。在75%的相似性水平处聚到了4个群。24株球菌中只有10株菌聚群，其它14株菌单独聚群。各表观群的菌株抗逆性都不尽相同，对抗生素的敏感性也存在一定的差别。
&&&&& 数值分类群1由2株未知菌株组成，分别来自雅安1株，乐山1株。该菌群对抗生素敏感；在含3%NaCl、4%NaCl的培养基中生长，部分耐6.5%NaCl、8%NaCl；不能在10℃生长，部分在15℃、45℃生长；不能在pH9.2环境中生长；能利用碳源包括甘露醇、乳糖、棉籽糖、核糖、纤维二糖、麦芽糖、葡萄糖，不利用海藻糖、肌醇、木糖、甘油；能水解淀粉，部分水解精氨酸，发酵葡萄糖部分产气。
&&&&& 数值分类群2是由1株未知菌与参比菌株B8乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactic subsp. lactis）组成，说明该菌株在75％相似水平上的特性与B8的生理特性相似。该菌株来自成都。能利用的碳源包括甘露醇、棉籽糖、麦芽糖、山梨醇、葡萄糖、纤维二糖，不利用海藻糖、鼠李糖、肌醇、核糖、甘油；对抗生素敏感；不能在10℃、5℃生长，在15℃生长；在pH9.2不生长；部分耐12%NaCl、15%NaCl；不水解淀粉，能水解精氨酸，发酵葡萄糖不产气。
&&&& 数值分类群3由3株未知菌株组成，分别来自成都1株，阿坝汶川县2株，其中，菌株17-1和菌株G3-2在82%的相似性水平上被聚在一起。利用的碳源包括甘露醇、乳糖、鼠李糖、海藻糖、核糖、麦芽糖、葡萄糖、山梨醇，不利用棉籽糖、肌醇、甘油；水解淀粉，部分水解精氨酸，发酵葡萄糖部分产气；对链霉素（10U/片）没有抗性；都能产生葡聚糖，是区别于其它菌群的显著特征；部分在含12%NaCl培养基生长，不耐15%NaCl；在10℃、15℃生长，部分在45℃生长，不在50℃生长；部分在pH3.5、pH9.2生长。
&&&&& 数值分类群4由3株未知菌株组成，都来自成都。能利用的碳源包括乳糖、海藻糖、核糖、麦芽糖、葡萄糖，不利用棉籽糖、阿拉伯糖、木糖、肌醇、甘油；对链霉素（10U/片）不敏感；在10℃、15℃生长，45℃不生长；在pH3.5、pH9.2、 pH9.6生长；水解淀粉，部分水解精氨酸，发酵葡萄糖不产气。
&&&& 从整个聚类分析结果来看，24株球菌比较分散，另有14株球菌单独聚群，其中包括一株参比菌株B5肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranium）。同时相似性系数未达到100%，而仅为82%相似性水平。其余13株菌分别来自雅安2株，内江1株，峨眉山3株，成都4株，宜宾1株，重庆2株。说明从这些地区分离的泡菜乳酸菌具有较大的表型多样性，对这些菌株还需作进一步研究。
3.2.1.2 乳酸杆菌数值分类结果及各表观群的描述
&&&&& 从树状图, 2中可以看出，供试菌株在55%相似水平上聚类，而参比菌株B14 短乳杆菌(L.brevis)在55%相似水平上就未与其它菌株聚类，成独立群。在75%相似水平上将94株（菌株编号见附录）来自四川不同地点和不同泡菜材料的乳酸杆菌和12株, 参比菌株分成了24个独立的表观群聚，其中89株菌聚群，其它17株菌单独聚群，包括5株参比菌株。这些菌株抗逆性较强，耐盐性较强，大多能在含6.5%NaCl的MSR培养基中生长；耐酸能力也较强，大多数能够在 pH3.5环境中生长，但耐碱能力较弱，只有少数菌株能在pH9.2环境中生长；耐高温能力也较强，大多能够在45℃生长；供试菌株对青霉素敏感，不能在含20U/片青霉素的培养基中存活，大多数不能在含20U/片链霉素中存活。
&&&&& 数值分类表观群1由6株未知菌株组成，其中2株来自峨眉山，3株来自雅安，1株来自成都，该群菌株能利用的碳源包括甘露醇、核糖、麦芽糖、葡萄糖、淀粉，少数不利用乳糖、纤维二糖；对抗生素敏感；耐盐性较强，能在含12%NaCl的培养基生长；较耐高温，能在45℃生长；部分能在pH9.6的培养基中生长；能利用淀粉，除菌株23外发酵葡萄糖不产气。
数值分类表观群2由3株未知菌株组成，1株来自雅安，2株来自隆昌。该群能利用的碳源包括甘露醇、乳糖、海藻糖、核糖、麦芽糖、葡萄糖，少数利用纤维二糖、阿拉伯糖、肌醇、甘油；对抗生素敏感；不耐高温；部分菌株能在pH9.2、 pH9.6生长；能利用淀粉，发酵葡萄糖产气；部分菌株能够在含8%NaCl的培养基中, 生长。
&&&&& 数值分类群3由6株未知菌株和参比菌株B7干酪乳杆菌干酪亚种（L.casei subsp.casei）组成，说明该群可能为干酪乳杆菌干酪亚种群。其中来自峨眉山3株，雅安1株，隆昌1株，泸州1株。能利用碳源甘露醇、乳糖、麦芽糖、葡萄糖；对抗生素敏感；部分在45℃生长, ；耐碱能力强，能在pH9.2环境中生, 长，部分在pH9.6存活；部分利用淀粉，发酵葡萄糖产气。
&&&&& 数值分类群4是由8株菌株组成，其中参比菌株B12 棒状乳杆菌棒状亚种(L.coryniformis)，说明该菌群可能为棒状乳杆菌棒状亚种群。7株未知菌株，来自雅安1株，隆昌1株，乐山2株，成都3株。能以甘露醇、麦芽糖、山梨醇、纤维二糖为唯一碳源，不利用马尿酸钠、甘油；对链霉素（10U/片、20U/片）、青霉素（10U/片、20U/片）有抗性；不在pH9.2、 pH9.6生长；部分在10℃、45℃生长；, 能在含12%NaCl、15%NaCl培养基中生长；能水解七叶苷，利用淀, 粉，部分菌株发酵葡萄糖产气。
&&&&& 数值分类群5是由2株未知菌株组成，均来至雅安，能以甘露醇、乳糖、棉籽糖、海藻糖、核糖、纤维二糖、阿拉伯糖、麦芽糖、葡萄糖、木糖作为唯一碳源，不利用鼠李糖；在10℃、45℃条件下生长；在pH9.2生长；对抗生素不敏感，仅对青霉素（20U/片）有抗性；能够利用淀粉，发酵葡萄糖不产气。
&&&&& 数值分类群6是由5株未知菌株组成，分别来自雅安2株，隆昌1株，阿坝汶川县1株，成都1株。该群能利用的碳源包括乳糖、海藻糖、核糖、纤维二糖、麦芽糖、葡萄糖，部分利用阿拉伯糖、山梨醇、肌醇、木糖、葡萄糖酸钠；对抗生素敏感；在10℃条件下生长，部分在45℃生长；能在pH3.5环境中生长；能利用淀粉，部分发酵葡萄糖产气。
&&&& 数值分类群7由7株菌株组成，参比菌株B13 干酪乳杆菌干酪亚种（L.casei subsp.casei），6株未知菌株中，峨眉山2株，阿坝汶川县1株，雅安1株，成都2株。能利用的碳源有甘露醇、阿拉伯糖、麦芽糖、葡萄糖，部分利用乳糖、棉籽糖、鼠李糖、海藻糖、纤维二糖、木糖，不利用甘油；对抗生素敏感；能在含12%NaCl培养基生长，不耐15%NaCl；在10℃、45℃生长；部分能在pH3.5、pH9.2生长，在pH9.6不生长；部分分解精氨酸，能水解淀粉，部分发酵葡萄糖产气。
&&&&& 数值分类表观群8由3株未知菌株组成，1株来自雅安，2株来自成都。该群以甘露醇、乳糖、棉籽糖、海藻糖、纤维二糖、阿拉伯糖、麦芽糖、葡萄糖、山梨醇作为唯一碳源，部分利用鼠李糖、核糖；对抗生素敏感；耐盐能力强，能在含15%NaCl的培养基中生长；部分在10℃、15℃生长，在45℃不生长；不耐碱，在pH9.2 、pH9.6都不生长；能利用淀粉，部分分解精氨酸，发酵葡萄糖部分产气。
&&&&&数值分类表观群9是由3株未知菌群组成，1株来自阿坝汶川县，1株来自雅安，1株来自西昌。能利用的碳源包括乳糖、纤维二糖、麦芽糖、鼠李糖，不利用核糖；对抗生素有一定敏感性，对头胞霉素（10U/片、20U/片）、链霉素（10U/片）没有抗性；能在含15%NaCl培养基生长；部分在50℃存活；有一定的耐碱能力；利用淀粉，不水解精氨酸，发酵葡萄糖不产气。
&&&&& 数值分类表观群10由两株未知菌株和参比菌株B3噬酸乳杆菌（L.acidophilus）组成，2株未知菌株分别来自雅安和宜宾。能利用的碳源为甘露醇、乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖、葡萄糖；对抗生素敏感；能在pH9.2生长；部分也能在, 50℃高温生长；能在含6.5%NaCl培养基生长；能利用淀粉，部分分解精氨酸，发酵葡萄糖不产气。
&&&&& 数值分类表观群11由2株未知菌株组成，分别来自阿坝汶川县、遂宁。该群能以甘露醇、乳糖、鼠李糖、海藻糖、核糖、麦芽糖、葡萄糖、山梨醇作为唯一碳源；对抗生素敏感；能在含12%NaCl培养基生长；在10℃生长，在45℃不生长；不利用淀粉，不分解精氨酸，发酵葡萄糖产气。
数值分类表观群12由9株未知菌株组成，分别来自雅安7株，隆昌1株，重庆1株。能利用甘露醇、乳糖、麦芽糖、葡萄糖，不利用阿拉伯糖、山梨醇、甘油；对抗生素有一定的抗性；耐盐能力较弱，部分能在含4%NaCl培养基生长；耐高温能力强，部分能在60℃30min生长；部分在pH9.2生长；利用淀粉，部分水解精氨酸，发酵葡萄糖不产气。
&&&&& 数值分类群13由4株未知菌株组成，分别来自雅安1株，西昌1株，泸州1株。该菌群能利用的碳源包括甘露醇、纤维二糖、麦芽糖、葡萄糖，不利用鼠李糖、山梨醇、甘油、肌醇；对抗生素有抗性，除链霉素（10U/片、20U/片）外；耐高温能力强，在50℃、60℃能生长；部分在含3%NaCl、4%NaCl培养基生长；能利用淀粉，部分水解精氨酸，发酵葡萄糖不产气。
&&&&& 数值分类群14由2株未知菌株组成，都来自雅安。该类群部分以甘露醇、乳糖、棉籽糖、核糖、葡萄糖、山梨醇作为唯一碳源，对海藻糖、纤维二糖、阿拉伯糖、木糖、甘油、肌醇、葡萄糖酸钠不发酵产酸；抗逆性弱，仅对青霉素（10U/片、20U/片）、链霉素（20U/片）有抗性；部分在含3%NaCl培养基生长；在10℃、45℃能生长；在pH9.2生长，但不能在pH9.6生长；能利用淀粉，部分水解精氨酸，发酵葡萄糖不产气。
&&&&& 数值分类群15由2株未知菌株组成，1株来自雅安，1株来自重庆。能利用甘露醇、乳糖、棉籽糖、海藻糖、核糖、麦芽糖、葡萄糖、木糖，不水解七叶苷；对头胞霉素（10U/片、20U/片）、庆大霉素（10U/片、20U/片）敏感；部分在10℃、50℃生长；能在含3%NaCl、4%NaCl培养基生长；部分在pH9.2生长，在pH9.6不生长；利用淀粉，发酵葡萄, 糖产气。
&&&&& 数值分类群16由4株未知菌株组成，分别来自雅安1株，成都2株，泸州1株。其中菌株B-2和C-2在98%相似性水平上聚在一起。能以乳糖、棉籽糖、海藻糖、麦芽糖、葡萄糖、山梨醇、葡萄糖酸钠作为唯一的碳源；对所测定的药敏试剂都有抗性；能在含3%NaCl培养基生长；在10℃、45℃生长；具一定耐碱能力，能在pH9.2生长，在pH9.6不生长；部分分解淀粉，发酵葡萄糖部分产气。
&&&&& 数值分类群17由2株未知菌株组成，1株来自泸州，1株来自隆昌。该菌群利用的碳源包括甘露醇、乳糖、棉籽糖、海藻糖、纤维二糖、麦芽糖、木糖，不利用鼠李糖、阿拉伯糖、甘油、肌醇；部分水解淀粉，部分水解精氨酸，发酵葡萄糖不产气；在含3%NaCl培养基不生长；10℃、45℃不生长，但能在15℃生长；pH9.2生长，部分在pH9.6生长。
&&&&& 数值分类群18由2株未知菌株组成，来自乐山1株，雅安1株。该群能以甘露醇、乳糖、棉籽糖、海藻糖、葡萄糖、山梨醇、甘油为唯一碳源；能水解淀粉，发酵葡萄糖不产气，水解精氨酸；对抗生素庆大霉素（10U/片、20U/片）、头胞霉素（20U/片）有一定抗性；能在含12%NaCl培养基生长；部分在10℃、45℃生长；部分在pH9.2生长，在pH9.6不生长。
数值分类群19由2株未知菌株组成，都来自隆昌。以甘露醇、乳糖、核糖、麦芽糖、葡萄糖、山梨醇为唯一碳源；对抗生素链霉素（10U/片）没有抗性；能耐12%NaCl、15%NaCl；耐高温能力较差，不能在45℃生长；在pH9.2、pH9.6不生长；能水解淀粉，水解精氨酸，发酵葡萄糖不产气。
&&&&& 数值分类20由2株未知菌株组成，都来自成都，该群能以甘露醇、乳糖、棉籽糖、麦芽糖、山梨醇、木糖为唯一碳源；对抗生素敏感；能水解淀粉，水解精氨酸，发酵葡萄糖不产气；能在含12%NaCl、15%NaCl培养基生长；在10℃、45℃生长，部分在50℃生长；仅部分在pH9.2生长。
&&&&& 数值分类21由参比菌株B1德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）和1株未知菌株组成，来自峨眉山。该群能以海藻糖、纤维二糖为唯一碳源，不利用棉籽糖、核糖、甘油、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖；部分在10℃生长，但不能在45℃生长；耐盐性较强，能在含12%NaCl培养基生长，但不耐15%NaCl；部分在pH9.2生长；能水解淀粉，不水解精氨酸，发酵葡萄糖不产气。
&&&&& 数值分类22由1株未知菌株和参比菌株B16植物乳杆菌（L.plantarum）组成，菌株来自贵州。该群能以核糖、纤维二糖、麦芽糖、葡萄糖为唯一碳源，不利用乳糖、山梨醇、甘油、肌醇；能水解淀粉，部分水解精氨酸，发酵葡萄糖部分产气；仅对抗生素庆大霉素（10U/片、20U/片）、链霉素（20U/片）有抗性；能在含12%NaCl、15%NaCl培养基生长；不能在10℃生长，但在45℃生长；部分在pH9.2生长。
&&&&&& 数值分类23由2株来自雅安的菌株组成，能以甘露醇、乳糖、鼠李糖、海藻糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨醇为唯一碳源，不利用棉籽糖、甘油、阿拉伯糖、肌醇；除对头胞霉素（10U/片）、链霉素（10U/片）不具抗性外，对其他抗生素敏感；抗逆性强，能在含12%NaCl、15%NaCl培养基生长；在pH9.2、pH9.6生长；在60℃30min生长，这些特性是有别于其它菌群显著的生理特性。能水解淀粉，水解精氨酸，发酵葡萄糖部分产气。
&&&&&& 数值分类24由参比菌株B9瑞士乳杆菌（L.helveticus）和1株未知菌株组成，能以乳糖、纤维二糖、麦芽糖为唯一碳源，不利用海藻糖、山梨醇、木糖、甘油；能水解淀粉，不水解精氨酸，发酵葡萄糖不产气；对抗生素庆大霉素（10U/片、20U/片）不产生抗性；在10℃生长，不能在45℃生长；部分在pH3.5、pH9.2、pH9. 6生长；能在含3%NaCl培养基生长，部分耐4%NaCl。
&&&&& 从整个杆菌树状聚类图来看，还有除参比菌株外的12株未知菌株单独聚群。说明对这些菌株还需作进一步的研究。
3.3 鉴别特征的选取
& &在测定的各项生理生化指标中，将出现频率R95%的特征作为鉴别特征，即各群中95%以上菌株表现为阳性反应的特征记为“+”，均为阴性者记为“-”，介于6%~95%之间记为“d”，经统计，数值分类各表观群的鉴别特征见表3,4。
筛选产抑菌活性物质――细菌素的乳酸菌
&&&&& 采用牛津杯法检测所分离的116株乳酸菌对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌能力。结果从发酵液对指示菌所产生的抑菌圈大小显示，杆菌A-13、J-5、G1-5、7-4、6-7、A-7的发酵液对指示菌有很强的抑制能力。实验结果见表5、图3。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 表5 发酵液对指示菌抑菌效果（一）
&&&&&&&&&&&&&&& Table5 Antimicrobial results of isolated LAB against indicator（one）
&&&&&&&&&&&& 抑菌效果（直径以mm表示）
指示菌&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 抑&&&&& 制&&&&&&& 菌
3.4.1 乳酸菌抑菌活性物质鉴定
&&&&& 乳酸菌在发酵过程中除代谢产生细菌素外，还将形成以乳酸为主的有机酸
类物质。不同研究表明，有机酸对不同种属的细菌都有一定的抑制作用，因此
确定抑菌活性是否由乳酸菌所产生的细菌素所致，就应该排除几种可能性：（1）
排除乳酸菌在发酵过程中产生的过氧化氢的干扰；（2）排除乳酸菌发酵过程中
产生的有机酸类物质的干扰；（3）检测附加过程中蛋白质含量的变化。
3.4.1.1 酸性末端产物和过氧化氢的排除
&&&&& 为了进一步验证对指示菌的抑制是由发酵液中的细菌素所致，排除有机酸类物质和过氧化氢的干扰，将上述6株菌的发酵液pH值用1N NaOH溶液调pH=6.0，再将发酵液置于100℃水浴中加热10min，采用牛津杯法测定发酵液的抑菌活性。由于过氧化氢不稳定，温度升高容易分解，因此可以通过加热来排除发酵液中过氧化氢的干扰。结果见表6。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 表6 发酵液对指示菌抑菌效果（二）
&&&&&&&&&&&&&&&& Table 6& Antimicrobial results of isolated LAB against indicator（two）
&&&&&&&&&&& 抑菌效果（直径以mm表示）
&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 抑&&&& &制&&&&&&& 菌
3.4.1.2 考马斯亮蓝G-250法检测附加过程中蛋白质含量的变化&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&& 采用考马斯亮蓝G-250法，对上述6株菌株进行24h内不同发酵时间发酵液蛋白质含量的测定。结果见图4
&&&& 从上述曲线可以看出，6株菌株在发酵过程中蛋白质含量表现为一个先下降后升的趋势，并且菌株A-13、J-5、6-7、7-4、A-7都有蛋白质高峰出现，说明抑制作用可能是由蛋白类物质引起。而菌株G1-5在24h后蛋白质含量稍有回升的趋势，这可能与发酵过程中乳酸菌细胞自溶有关。
人工接种乳酸菌对泡菜中亚硝酸盐含量影响及其pH变化的测定
亚硝酸盐含量的测定
&&&& 将上述产细菌素的乳酸菌人工接种于泡菜中进行发酵，并以自然发酵泡菜作为对照。采用盐酸萘乙二胺法测定泡菜发酵过程中亚硝酸盐含量的变化。在不同处理方式下，亚硝酸盐含量变化分析结果见图5。
&&&& 由图5可知，在泡菜发酵过程中，亚硝酸盐含量呈规律变化,到第二天亚硝酸盐均出现一个明显的NO2-高峰。自然发酵出现的亚硝峰明显高于人工接种乳酸菌的亚硝峰，峰值为110.0&g/mL。随着环境pH的降低和总酸度的增加，亚硝酸盐迅速降低，在第七天为8.56&g/mL。人工接种乳酸菌的亚硝峰明显低于自然发酵的，表明人工接种发酵有利于抑制亚硝酸盐的生成，减少亚硝酸盐含量积累。这是由于人工接种的泡菜坛中的乳酸菌一开始就远远高于自然发酵中的乳酸菌，能立即进行乳酸发酵，产生大量乳酸，从而有效地抑制泡菜坛中不耐酸的其它杂菌的活动（李锡香，1995）。同时，乳酸菌能够使 NO2-的还原过程相对加快，故使亚硝峰值降低（赵书欣，1998）。并且硝酸还原酶的适宜pH值为7～7.5，随着环境酸度增加，pH降低，还原酶活降低，甚至无活性，促使亚硝酸盐降解，从而减少亚硝酸盐与二级胺反应生成致癌物质――亚硝胺（唐爱明，夏廷斌等，2004）。由于人工接种的乳酸菌不同，泡菜中亚硝酸盐残留量也不同。在人工接种A-7、A-13、J-5和7-4的泡菜中亚硝峰值相对较高;而人工接种6-7纯菌种的泡菜亚硝酸盐含量最小,峰值约为28.0&g ?g-1,并且在整个测定期间都保持较低含量。
值的分析&&&& 为了分析整个过程中，乳酸菌对亚硝酸盐的降解能力与发酵过程中的pH值的关系。在测定亚硝酸盐含量的同时，对泡菜汁中的pH值进行测定，结果见图6。
&&&& 从图6中可以看出人工接种的泡菜pH变化趋势都较明显，这与接种乳酸菌后，乳酸菌产生大量的乳酸使环境中pH快速下降有密切关系。其中7-4的pH变化趋势最明显，降低得最快，pH值最低，最终pH可达到3.40。就对照而言，整个发酵过程中pH变化趋势最为缓慢，pH值降低趋势的也最为平缓。
种属鉴定结果
&&&& 在数值分类的基础上，依据数值分类试验中测定性状，结合《伯杰细菌鉴定手册》（1984年版）、《常见细菌系统鉴定手册》（2001年）、《Berger’s Manual of Systematic Bacteriology》（1984年版）、《乳酸菌分类鉴定及实验方法》（1999年）中的描述，对116株未知乳酸菌做种属判定。
乳杆菌属种的鉴定
&&& 本试验以B1德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、B2德氏乳杆菌德氏亚种（L. delbrueckii subsp. delbrueckii）、B3噬酸乳杆菌（L.acidophilus）、B4植物乳杆菌（L.plantarum）、B6双发酵乳杆菌（L.bifermentans）、B7干酪乳杆菌干酪亚种（L.casei subsp.casei）、B9瑞士乳杆菌（L.helveticus）、B11发酵乳杆菌（L.fermentium）、B12 棒状乳杆菌棒状亚种(L.coryniformis)、B13 干酪乳杆菌干酪亚种（L.casei subsp.casei）、B14 短乳杆菌(L.brevis)、B15 布氏乳杆菌(L.buchneri)、B16植物乳杆菌（L.plantarum）为参照菌株，根据文献[凌代文，东秀珠，1999；赵斌，何绍江，2002；李季伦等，1995；东秀珠，蔡妙英，2001；R.E.布坎南，N.E.吉本斯，1984；Peter H.A.Sneath,1984]，那分离得到的94株无芽孢、革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、明胶液化试验、吲哚试验、联苯胺试验、硝酸盐还原试验中反应阴性，pH4.5生长的菌株鉴定为乳杆菌属（Lactobacillus）的细菌。其中菌株31、35、104、、2913(1)、297、324、A18、A22、B2、C6、C11、G18、H、M5、U2、Y2共18株菌株分解葡萄糖产酸产气，属于异型乳酸发酵乳杆菌；其余75株菌株发酵葡萄糖产酸不产气，属于同型乳酸发酵乳杆菌。
&&&&& 菌株33、A17、A18、2913、Y2、A10等6株菌株与参比菌株B7干酪乳杆菌干酪亚种（L.casei subsp.casei）在75%相似水平上聚在一起，糖发酵结果与《手册》、《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》、《乳酸菌――生物学基础及应用》描述的一致，鉴定为干酪乳杆菌干酪亚种（L.casei subsp.casei）。
&&&&& 菌株31、166、2911、J5、301、P1、R17等7株未知菌株与参比菌株B12 棒状乳杆菌棒状亚种(L.coryniformis)在76%相似性水平上聚在一起，糖发酵结果与《手册》、《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》、《乳酸菌――生物学基础及应用》描述的一致，鉴定为棒状乳杆菌棒状亚种(L.coryniformis)。
&&&& &菌株72、A13、C5、A22、G15、K17等6株菌株与参比菌株B13 干酪乳杆菌干酪亚种（L.casei subsp.casei）在76.5%相似水平上聚在一起，糖发酵结果与《手册》、《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》、《乳酸菌――生物学基础及应用》描述的一致，鉴定为干酪乳杆菌干酪亚种（L.casei subsp.casei）。
菌株34、363与参比菌株B3噬酸乳杆菌（L.acidophilus）在75.2%相似水平上聚在一起，糖发酵结果与《手册》、《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》、《乳酸菌――生物学基础及应用》描述的一致，鉴定为噬酸乳杆菌（L.acidophilus）。
&&& 菌株N1与参比菌株B4植物乳杆菌（L.plantarum）、B16植物乳杆菌（L.plantarum）在76.5%相似水平上聚在一起，糖发酵结果与《手册》、《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》、《乳酸菌――生物学基础及应用》描述的一致，鉴定为植物乳杆菌（L.plantarum）。
&&&&&菌株N14与参比菌株B9瑞士乳杆菌（L.helveticus）在75%相似水平上聚在一起，糖发酵结果与《手册》、《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》、《乳酸菌――生物学基础及应用》描述的一致，鉴定为瑞士乳杆菌（L.helveticus）。
菌株A12与参比菌株B1德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）在79.5%相似水平上聚在一起，糖发酵结果与《手册》、《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》、《乳酸菌――生物学基础及应用》描述的一致，鉴定为德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）。
&&&& 菌株325、B5发酵葡萄糖不产气，能利用甘露醇、乳糖、棉籽糖、海藻糖、核糖、纤维二糖、阿拉伯糖、麦芽糖、葡萄糖、木糖，不能利用鼠李糖，从精氨酸不产氨，能在15℃生长，符合植物乳杆菌（L.plantarum）特征。但能不利用葡萄糖酸钠，不符合《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》描述的特征。
&&&& 菌株35、G31、R2、108、133等5株未知菌株能利用甘露醇、乳糖、海藻糖、核糖、纤维二糖、麦芽糖、葡萄糖，大多数能利用棉籽糖、阿拉伯糖、葡萄糖酸钠，不利用鼠李糖，精氨酸不产氨，能在15℃生长，符合植物乳杆菌（L.plantarum）特征，符合《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》描述的特征。
&&&& 菌株A14、B1两株未知菌株能利用麦芽糖、葡萄糖，不利用海藻糖、纤维二糖、阿拉伯糖、木糖，部分利用甘露糖、乳糖、棉籽糖、鼠李糖、核糖、七叶苷、山梨醇，葡萄糖发酵产酸不产气，精氨酸不产氨，并在15℃生长，符合棒状乳杆菌棒状亚种(L.coryniformis)的特征，符合《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》描述的特征。
菌株2913(1)、M5等未知菌株能利用甘露醇、乳糖、棉籽糖、海藻糖、核糖、麦芽糖、葡萄糖，不利用鼠李糖、纤维二糖、山梨醇、葡萄糖酸钠，符合唾液乳杆菌水杨素亚种（L.salivarius subsp. salicinius）的特征，但水解七叶苷，利用木糖，在15℃生长，不符合《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》描述的特征。
&&&&& 菌株B2、C2、U2、C11等4株菌株能利用乳糖、棉籽糖、海藻糖、纤维二糖、阿拉伯糖、麦芽糖、葡萄糖、山梨醇、木糖、葡萄糖酸钠，符合戊糖乳杆菌（L.pentosus）的特征，符合《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》描述的特征。
菌株135、Y3等能利用乳糖、棉籽糖、海藻糖、纤维二糖、水解七叶苷、麦芽糖、木糖，不利用鼠李糖、阿拉伯糖，精氨酸不产氨，符合草乳杆菌（L.graminis）的特征，但能利用甘露醇、山梨醇不符合《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》描述的特征。
&&&&& 菌株 G18、H等2株未知菌株细胞大小均一，两端钝圆，可在15℃生长，不在45℃生长，精氨酸不产氨，能利用麦芽糖、核糖、葡萄糖产酸产气，不发酵阿拉伯糖、纤维二糖基本符合绿色乳杆菌（L.viridescens）的特征，但发酵山梨醇、海藻糖产酸，不发酵葡萄糖酸钠与《手册》的描述不一致。
&&&& 菌株136、132等能发酵甘露醇、乳糖、核糖、麦芽糖、葡萄糖、产酸，不能发酵鼠李糖、七叶苷、阿拉伯糖、木糖产酸，菌株136不发酵海藻糖，符合肠乳杆菌 (L.intestinalis)的特征，但发酵山梨醇产酸，不符合《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》描述的特征。
菌株73、A16、7-9、93、298、107、M2、等9株未知菌株发酵甘露醇、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、多数发酵鼠李糖产酸，不发酵阿拉伯糖、山梨醇产酸，从精氨酸部分产氨，在15℃生长，基本符合玉米乳杆菌（L.zeae）的生化特征描述，但73、A16、7-9、107、M2、1011发酵七叶苷产酸，73、A16发酵木糖产酸不满足《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》描述的特征。
&&&& 菌株74、18、I11、A15等4株未知菌株能在15℃、45℃生长，菌株18、I11、A15还能在50℃生长，能利用甘露醇、麦芽糖、纤维二糖、七叶苷，多数利用乳糖、棉籽糖、海藻糖、核糖、阿拉伯糖、木糖产酸、不利用鼠李糖、山梨醇，葡萄糖发酵产酸不产气，鉴定为干酪乳杆菌假植物亚种（L.casei subsp.pseudoplantarum），符合《手册》的描述。
菌株17、A11、A7、、C9等6株未知菌株能利用纤维二糖、葡萄糖、麦芽糖、核糖、七叶苷、大多数利用乳糖发酵产酸，不利用鼠李糖、棉籽糖、阿拉伯糖、木糖，在15℃、45℃生长，符合弯曲乳杆菌（L.curvatus）生化特征，但大多数发酵甘露醇，海藻糖产酸不满足《手册》。
&&&& 菌株、297等3株菌株利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、葡萄糖酸钠产酸，不利用阿拉伯糖、纤维二糖、棉籽糖、鼠李糖、山梨醇、木糖、七叶苷发酵产酸，符合棒状乳杆菌扭曲亚种（L.coryniformis subsp.torquens）的特征，但发酵核糖产酸不满足《手册》的描述。
&&&& 菌株62、C4、C6等菌株能利用甘露醇、乳糖、棉籽糖、鼠李糖、七叶苷、海藻糖、纤维二糖、阿拉伯糖、麦芽糖、葡萄糖、山梨醇发酵产酸、不发酵核糖、木糖、葡萄糖酸盐产酸，精氨酸不产氨，15℃不生长，鉴定为鼠乳杆菌（L.murinus），满足《手册》的描述。
菌株D2、G6、W1等3株未知菌株能发酵阿拉伯糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、棉籽糖、鼠李糖产酸，不利用纤维二糖、七叶苷、海藻糖、木糖产酸，符合类布氏乳杆菌（L.parabuchneri）的特征，但不发酵葡萄糖酸钠不满足《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》描述的特征。
&&&& 菌株A14等菌株在15℃生长，精氨酸不产氨，利用葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖发酵产酸，不利用纤维二糖、阿拉伯糖、七叶苷、葡萄糖酸钠、部分利用乳糖、棉籽糖、核糖、木糖发酵产酸，鉴定为双发酵乳杆菌（L.bifermentans），满足《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》描述的特征。
&&&& 菌株324、323在15℃、45℃都能生长，从精氨酸产氨，发酵纤维二糖、七叶苷、葡萄糖酸钠、葡萄糖、麦芽糖、核糖、木糖产酸，不发酵棉籽糖、鼠李糖、阿拉伯糖产酸，符合混淆乳杆菌（L.conllinoides）的特征，但发酵甘露醇、乳糖、山梨醇产酸不满足《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》描述的特征。
&&& 菌株82和F115两未知菌株，发酵葡萄糖、葡萄糖酸盐、乳糖、麦芽糖、核糖、海藻糖，不发酵阿拉伯糖、纤维二糖、七叶苷、木糖、棉籽糖、鼠李糖产酸，符合耐盐乳杆菌（L.halotolerans）的特征，但发酵乳糖、甘露醇、山梨醇产酸不满足《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》描述的特征。
&&& 菌株R13利用阿拉伯糖、纤维二糖、七叶苷、葡萄糖、麦芽糖、核糖发酵产酸，不利用乳糖、棉籽糖、鼠李糖、山梨醇、木糖产酸，鉴定为食品乳杆菌（L.alimentarius），符合《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》描述的特征。
乳球菌属种的鉴定
&&& 本试验以B8乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactic subsp. lactis）为参照菌株，在10℃生长，45℃不生长，4%NaCl生长，葡萄糖发酵产酸不产气，革兰氏染色阳性的球形或卵球形细菌，在过氧化氢酶阴性，明胶液化试验、联苯胺试验、硝酸盐还原试验中反应阴性，不运动的菌株定为乳酸球菌属（Lactococcus）的细菌（凌代文，东秀珠，1999；赵斌，何绍江，2002；李季伦等，1995；东秀珠，蔡妙英，2001；R.E.布坎南，N.E.吉本斯，1984；Peter H.A.Sneath,1984）。
&&&& 菌株J-2能利用甘露醇、乳糖、核糖、麦芽糖、葡萄糖、山梨醇发酵产酸，不利用棉子糖、鼠李糖、海藻糖、木糖、甘油、淀粉发酵产酸，精氨酸水解，符合《手册》、《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》的描述，鉴定为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis）。
菌株C-10、P-2两株未知菌株能够发酵利用乳糖、海藻糖、核糖、麦芽糖、葡萄糖产酸， 不能利用棉籽糖、阿拉伯糖、山梨醇、木糖产酸，能从精氨酸产氨，并且能够水解精氨酸，发酵葡萄糖产酸不产气，在pH9.2、pH9.6的培养基中生长，其中菌株C-10能产葡聚糖，菌株P-2还能在高盐浓度的培养基中生长，符合《手册》、《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》的描述，鉴定为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis）。
&&&&& 菌株C-3该菌株能利用鼠梨糖、海藻糖、核糖、纤维二糖、麦芽糖、葡萄糖、山梨醇产酸，不能利用甘露醇、乳糖、棉籽糖、阿拉伯糖、木糖等发酵产酸，从精氨酸不产氨，不水解精氨酸，并能产生葡聚糖，在含8%NaCl，12%NaCl培养基中都能生长，符合《手册》、《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》的描述，鉴定为植物乳球菌（L.plantarum）。
肠球菌属种的鉴定&&&& 本试验以B8乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactic subsp. lactis）为参照菌株，在.....................................................
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