PCR反应体系从20ul变为25ul要注意什么请问(反应体系,目的条带,引物,模板)
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[PCR反应体系从20ul变为25ul要注意什么请问(反应体系,目的条带,引物,模板)] 我原来的PCR反应体系是20ul：50nDNA模板、12.5pmol引物、0.1mMdNTP、10×PCRbuffer 、1.5uMMgCl2、1.0uTaq酶。循环条件是：95度 5分钟、95度 30秒、65度 30秒、72度 30秒、72度 10分钟，循环35次。结果目的条带出现，同时在目的条带下方出现非特异性条带和引物二聚体。我后来又跑了三管PCR，由于实验需要，将反应体系改为25ul，将退 关键词:[反应体系 目的条带 模板 引物 引物二聚体 退火温度 非特异性]…
我原来的PCR反应体系是20ul：50nDNA模板、12.5pmol引物、0.1mMdNTP、10×PCRbuffer 、1.5uMMgCl2、1.0uTaq酶。循环条件是：95度 5分钟、95度 30秒、65度 30秒、72度 30秒、72度 10分钟，循环35次。结果目的条带出现，同时在目的条带下方出现非特异性条带和引物二聚体。我后来又跑了三管PCR，由于实验需要，将反应体系改为25ul，将退火温度分别为65度、66度、67度，其余不变，可是却没有出现目的条带。极度郁闷中，由于本人是新手，所以请高手指教。本人不甚感激！！
一般不会出现这种情况.可能是你第二次加样的问题吧，再重新做一次试试。hxppxh 谢谢！明天一定是要重作的，不过我是想是不是从20uL到25Ul需要注意什么，我不是很清楚，导致目的条带的不出现从25变从50的体系到碰到过问题，估计是PCR问题，体系太大受热不均匀！~20变成25应该问题不大吧！~是不是开始用了heated lid,后来忘记用。我前阵子做的时候就是忘记摁PCR机器上的heated lid了。先分析试剂，然后分析。
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PCR的20uL体系扩出了目的带,很亮,但是50uL大量扩时有一条特短的短带,目的带很暗,是怎么回事
可能是体系太大了 误差太大 还有就是你的一起问题 还要注意的一点 pcr开始时有个选择体系的选项 别忘了改成50
体系扩大后就会出现扩不出来的情况的。你可以用两个25的体系或3个20的体系来做。
可是以前没出现过这种问题，还有我又重新用两个20的体系扩了一下，竟然一个正常，一个下面也有短的亮带，这是怎么回事呢？
呵呵，这个就不知道了。
应该是引物2聚体。
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根据模板浓度啊
如果浓度太低
比如模板就得加10ul
那肯定要更大的体系
还有就是需要回收的用大体系
菌P这种只是要看一下的用小体系
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