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上海科技兴农网基因沉默(gene silencing) 是指生物体中特定基因由于种种原因不表达。基因沉默是遗传修饰生物(genetically modified organisms) 实用化和商品化的巨大障碍。转基因沉默(Transgene silencing) 是指导入并整合进受体基因组中的外源基因在转化体的当代或其后代中表达受到抑制的现象。主要表现为表达水平大幅度降低,而且各独立转化体间出现显著差异。1990 年,Carolyn 等首先发现了植物转基因沉默现象[1 ] 。他们在把与花色有关的查尔酮合酶基因(Chalcone synthase gene , CHAD gene) 导入矮牵牛的研究中发现,50 %的矮牵牛转基因植株中导入的外源基因与同源的内源基因均发生了沉默。1994 年,Bryeyne和Montagu 对30 多家转基因植物商品化公司做了调查。调查显示,几乎所有的公司都遇到过不同程度的转基因沉默问题[2 ] 。植物转基因沉默或不稳定表达已成为更进一步研究和应用植物转基因技术的主要障碍。所以,目前植物转基因技术的研究热点已由80 年代偏重于基因分离、发展转化手段以及转化单个基因,转移到转基因沉默研究和基因表达时空性的调控上(Daniel R Gallie ,1998) 。随着研究的深入,发现基因沉默似可分为两种类型,即转录水平上的基因沉默(Transcriptional gene silencing , TGS) 和转录后的基因沉默(Post transcriptional gene silencing , PIGS) [3 ] ,转录水平上的基因沉默发生于转录的起始和终止,一般只有外源基因发生沉默;转录后的基因沉默发生在转录后,整合的外源基因转录后并不进行翻译,转基因植株不表现目标性状,后者通常是外源基因和内源基因一起沉默,因此,又称其为共抑制(Cosuppression) 。Matzke 认为共抑制的机理可能是一扇大门,提出了人们还没有考虑到的一个问题:植物似乎能天然利用同源或互补核酸序列,在RNA 和DNA 水平上调节基因的表达[4 ] 。因此,深入研究转基因沉默无论在理论上还是在实践上都具有重大意义。1 　转基因沉默的原因1. 1 　转录水平基因沉默( TGS ,DNA - DNA)1. 1. 1 　甲基化作用　甲基化作用是转录水平上表达调控的基本方式之一。由于宿主细胞基因组DNA中不同位点的甲基化程度存在某种平衡,并形成一定的空间结构特点。一旦转基因的整合破坏了这种平衡及空间特征,这种破坏后的结构便成为宿主基因组防御系统识别的信号,使新整合进去的DNA 序列发生不同程度的甲基化,甲基化基因序列则通过抑制甲基化DNA 结合蛋白(MeCP2) 的结合而抑制转录的顺利进行[5 ] 。1. 1. 2 　位置效应　由于转基因技术的限制,转基因均是在基因组DNA 序列的不同位置随机整合。如果转基因整合位置处于基因异染色质区或转录不活跃区,转基因就会在该区空间结构和成分影响下形成类似结构,导致转录不活跃或异染色质化而失活。转基因烟草中稳定表达的T - DNA 至少有一侧和基因组DNA 富含AT的核基质附着区相邻,并且位于端粒附近。而不能稳定表达的T - DNA 则位于异染色质及着丝粒旁[6 ] 。1. 1. 3 　正、反向同源基因、多拷贝重复基因引起的TGS 　转录水平上,同源基因在同源性较高或某些因子影响下,可发生相互作用而使同源序列发生甲基化并失活。同样,多拷贝重复基因序列整合进基因组后,无论正、反向都容易形成异位配对,引起基因组防卸系统的识别而被甲基化或异染质化失活[7 ] 。1. 1. 4 　复杂结构转基因引起的TGS 　组织结构复杂的转基因易形成不规则的结构,拥有更多的断裂热点,在与宿主基因组整合的过程中易产生DNA 置换、重排,也更易为宿主防御系统所识别。通过基因枪法将仅含基因表达盒(启动子,开放阅读框架,终止子) 的线性DNA 片段导入植物基因组,获得的大多是低拷贝数、低重排频率、高效表达的转基因植株。而使用结构相对复杂的完整质粒导入基因组后,产生的是高拷贝数、高重排频率的转基因植株,外源基因转录的活性及稳定性受到严重影响。1. 2 　转录后水平基因沉默( PTGS , RNA - RNA)PTGS 是植物基因表达调控的第二道关卡,通过细胞质内RNA 的特异性降解,控制内、外源mRNA的存留量来进行基因表达的精细调节、发育性调控。1. 2. 1 　RNA 域值(RNA threshold) 　Lindbo 等提出了RNA 阀值模型(RNA threshold model) ,认为在细胞质中可能存在mRNA 的监控系统。当某种mRNA 超量表达以后,监控系统就起作用,将这种超量表达的mRNA 降解。然而人们随后发现某些不带有启动子的基因转入细胞后同样也能引起PTGS 现象,其作用效果与带有启动子的序列相近。Olivier Voinnet[8 ]等在研究PTGS 在植物中的传递时发现,带有和不带有35S 启动子的GFP(Green fluorescent protein) 基因都能引起沉默。不带有启动子的GFP 基因在植物体中不能转录产生RNA ,却也能引起沉默,可见沉默并不一定都是外源基因的过量表达、转录产物的过量积累所造成的。1. 2. 2 　异位配对和异常RNA 　当病毒或转入的外源基因内部有同源序列,或者外源基因与内源基因之间有同源序列时,往往会导致异位配对( Ectopic pairing) [9 ] ,其结果是转录产生异常RNA (AberrantRNA ,aRNA) ,由于aRNA 内部的重复序列,它可能是双链的。另外,除了异位配对,aRNA 产生的原因还可能是外源基因中存在异常结构,如隐秘的旁侧启动子(Cryptic flanking promoter) 或提前终止末端(Premature termination) [10 ] 。aRNA 一旦产生并进入细胞质后,就会激活依赖于RNA 的RNA 聚合酶(RNA – depended RNA polymerase ,RdRps) 的活性,RdRps 再以aRNA 为模板合成大量约25 bp 的互补RNA (Complementary RNA ,cRNA) 。这些cRNA 如果与同源的mRNA 相遇就会结合上去形成部分双链结构———dsRNA。而后被双链特异性的RNase 识别、降解。在这一过程中,内源基因的同源转录产物也可能被cRNA 结合,并被同时降解。外源基因的导入最终导致内源和外源基因的表达共同受阻,这种现象在植物中被称为共抑制(Cosuppression) 。最近,许多实验为上述解释提供了证据。Hamilton[11 ]等在4 种发生PTGS 现象的植物中分别分离到了一种25 bp 左右的反义RNA ,这些RNA 很可能就是cRNA。Carlo Cogoni 等[12 ]从粗糙链胞霉中分离到了qde - 1 (Quelling defective) 基因,它可能编码一个含1 402 个氨基酸的蛋白质。同源性比较表明它是一种RdRp 。另外Caenarhabditis elegans 中的Ego - 1[13 ] ,拟南芥中的Sgs - 2[14 ,15 ]都可能是一种RdRp ,这些蛋白质具有同源性,说明它们在进化上是保守的,而在同一物种中这些蛋白质同一家族中的成员之间又有明显差异,表明同一家族的成员在细胞中可能具有不同功能。Carlo Cogoni[16 ]还在粗糙链孢霉中发现了Qde - 3 基因,将Qde - 3 与蛋白质库中的其它蛋白质比较,表明它属于RecQ DNA 螺旋酶,其功能是解开双链DNA ,参与DNA 结构的改变和aRNA 的转录。这表明RecQ 蛋白家族不仅与DNA 的重组和修复有关,还有其它功能。最近,Wu Scharf D[17 ,18 ]从衣藻中又分离到了nud - 6 基因,它编码的蛋白质与DEAH - box 家族的RNA 螺旋酶高度同源,它可能是一种参与aRNA 降解的螺旋酶。这些蛋白质的发现为异常RNA 模型提供了部分证据,然而,也有实验表明,如果将单拷贝的外源基因转入无同源性基因的单倍体植物中以后,也会导致PTGS 现象。这表明,同源序列之间的异位配对,也不是导致PTGS 现象的唯一原因。1. 2. 3 　双链RNA 　Waterhouse[9 ]等将正义RNA 和反义RNA 导入植物后,发现正义RNA 与反义RNA 共转录比二者单独作用更易引起沉默。于是他们认为异位配对并不是导致PTGS 的根本原因,根本原因在于外源基因插入受体基因组中的方向不同,这将导致正义RNA 和反义RNA 的合成。这些转录产物将形成dsRNA ,dsRNA 在细胞质中被螺旋酶、RdRps 和类似于RNase L 的核酸内切酶形成的复合体所识别。螺旋酶使双链解旋,RdRps 以其中一条链为模板合成cRNA ,类似于Rnase L 核酸内切酶结合于cRNA 的两端,当cRNA 与具有同源序列的mRNA 结合以后,RNsae L 的作用是在单链处切开mRNA 分子。单链RNA 分子由于没有5′帽子和Poly(A) 尾巴,很快被其它RNase 降解。2 　解决转基因沉默的对策转基因沉默是外源基因在转基因植物中受宿主遗传系统多级调控以及外源基因与内源基因相互作用的结果。为了克服转基因沉默对植物基因工程的阻碍,目前,研究者一般采用下列对策:2. 1 　选择单拷贝转基因植株由于多拷贝可以导致基因沉默,因此,使用适当转化方法降低多拷贝插入频率,可以部分克服转基因沉默。2. 2 　去甲基化5 - 氮胞嘧啶(5 - azacytosine , 5 - azaCyt) 及类似物具有很好的抑制转基因甲基化和去甲基化作用。Manfred 等在悬浮培养过程中用2. 5μmol/ L 的5 - 氮胞苷(5 - azacytidine ,5 - azaC) 单一处理高甲基化的转基因烟草细胞,处理后使高甲基化的外源基因(ipt) 的甲基化程度比处理前低2/ 3 ,同时又不抑制细胞的生长,有效地解除了由于甲基化导致的基因沉默[19 ] 。另外,在载体上加上去甲基化的序列也有助于防止外源基因甲基化。2. 3 　在转基因的侧翼接上MAR序列或SAR序列MAR(Matrix Attachment Region , MAR) 是指与核基质特异性结合的序列;SAR(Scaffold Attachment Region ,SAR) 则指与核骨架特异性结合的序列。染色体在MAR 或SAR 处与核基质或核骨架相结合,使结合点之间的染色体形成环状结构,可以降低环境对基因活性的影响。试验表明,来自鸡溶菌酶基因的MAR 序列可明显降低植物转基因插入位点造成的位置效应[20 ] 。1996 年,George 等人用基因枪法进行烟草转化时发现,在GUS 基因两侧加上SAR ,可使其表达活性比对照提高140 倍[21 ] 。2. 4 　合理利用增强子利用具有组织与发育特异性调控作用的增强子是提高外源基因的表达效果的有效措施之一。现已发现动物免疫球蛋白K链基因的增强子可在细胞发育的特定阶段指导该基因区段去甲基化,从而启动基因转录[22 ] 。1988 年,Schwechheimer 等用烟草烤烟栽培种“沙姆逊”的叶肉原生质体和BMS(B1ack Mexican Sweet) 细胞进行悬浮培养,并进行了富含Gln 的转录活性结构域、酵母活性转录因子(GAL4) 、疤疹单纯病毒蛋白(VP16) 的嵌合结构的瞬间表达。研究结果表明,结构基因上游激活位点的重复序列是强的转录活性所需要的,当GAL4 ×VPl6 嵌合基因的上游激活序列(Up - stream activation sequence ,UAS) 重复数为8 个时,报告基因的活性达到最高水平,在悬浮培养的BMS 细胞中插入同源多聚G1n 序列能增强转录活性[23 ] 。Sandhu 等报道,豌豆质体蓝素基因(petE) 启动子的富含A/ T 的负调控区域(在距转录启始位点- 44 到- 177 处) 在转基因烟草的叶片和转基因马铃薯的小块茎中增强了GUS 基因的表达水平[24 ] 。2. 5 　在构建外源基因载体时使用强启动子从番茄中获得了亮氨酸氨肽酶(Leucine aminopeptidase , LAP) 基因,该基因在转入番茄和马铃暮的过程中嵌入相应的GUS 基因5′非编码区。结果发现,该5′非编码区的LAP 基因上游- 317 到- 3 片段具有启动子功能[25 ] 。因此,在构建外源基因载体时,可先进行预备试验以选择最强的启动子,以利于外源基因在转基因植株中实现高效表达。3 　转基因沉默的应用目前,转基因沉默在植物基因工程中的应用尚未大范围开展,但其作用不可忽视,现在基因沉默的应用主要在以下几个方面进行:3. 1 　作物遗传育种通过反义RNA 与同源的内源基因转录的正义RNA 配对形成双链RNA ,进而降解,造成内源基因沉默,达到人们抑制植株某一内源基因转录的目的。3. 2 　功能性基因组学上的应用利用转基因沉默中的抑制效应,可以有目的性地、有选择性地抑制某一内源基因序列的活性,从而知道这一DNA 序列在植株基因组的功能。3. 3 　利用共抑制效应可以抑制植物代谢中某一关键酶基因的活性、中断该代谢循环的进程,从而使人们所需要的代谢产物能在某一代谢环节处不断积累下来而不会被进一步的反应消耗掉,获得高产量的特定代谢产物。综上所述,在短短几年之间,植物转基因沉默方面的研究获得了重大的进展,遮住人们视线的面纱正逐渐被掀开。针对这种情况,克服转基因沉默的方法越来越多,效果也越来越好。同时,植物转基因沉默应用已经得到开展,并显示出强大的潜在应用价值。4 　展　望虽然基因沉默可用于研究基因的功能和了解生物的发育等,但是转基因工程的最终目标是要克服基因沉默,让外源基因在植物体内稳定遗传与表达。基因沉默的产生是由于外源基因和内源基因的编码区之间存在着同源序列,因此,可用定点插入的方法,如噬菌体PlCre —lox 位点特异性重组系统,酵母线粒体I - SI 核酸内切酶特异性诱导植物DNA 双链断裂等来破坏内源基因的表达,避免共抑制的发生。此外,转基因沉默现象的发生与外界环境条件及人为因素紧密相关。不同光照、温度、培养条件、环境胁迫以及有性杂交和嫁接等处理都会造成转基因沉默,所以研究外界条件对转基因沉默影响也十分必要。研究表明烟草几丁质酶基因的沉默与早期的转基因植株的培养条件有关,使负责产生叶绿体膜中某种脂肪酸的基因“沉默”可以培育出更适应高温的转基因植物。总之,基因沉默是一个非常复杂和普遍的现象。随着人们对基因沉默分子机理研究的深入以及相关学科的发展,不仅能克服基因沉默,而且能揭示植物发育过程中的基因表达与调控机理,从而使转基因技术更好地为人类服务。参考文献:[1 ]Carolyn N C. 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3秒自动关闭窗口转Cry1Ab基因水稻侧翼序列的扩增和转化体特异事件检测--《沈阳师范大学》2012年硕士论文
转Cry1Ab基因水稻侧翼序列的扩增和转化体特异事件检测
【摘要】：近年来，全国转基因作物研究的迅速发展成功的解决了作物的抗病虫及抗逆等问题，同时也为其他问题的解决提供了很好的途径。除了获得了目标性状外，转基因作物由于外源基因的插入可能会影响原有的基因网络，引起转基因植物的生理生化变化及代谢途径的改变，进而使转基因作物产生非预期效应，成为粮食食用安全问题的潜在威胁因素。转基因作物潜在的安全性问题引起了人们广泛的关注，各国相继出台了相关的转基因标识管理法规，因此，作为转基因产品安全检测的研究显得尤为重要。本研究以共转化获得的不含筛选标记的44株转Cry1Ab基因水稻为材料，对外源基因在水稻染色体上的插入位点进行了分析，为转Cry1Ab基因水稻的代谢途径的研究做准备，同时也为其环境释放安全检测提供理论参考。
通过改进热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法，使用5个简并引物对44个转Cry1Ab基因水稻株系进行扩增，成功地分离并测定了36个株系的侧翼序列，成功率约为82%。利用生物信息学分析转Cry1Ab基因水稻外源插入基因的分子特征，结果表明这些植株大体上来自于四个转化事件，其中有24个材料属于第一个转化事件，其整合位点在第二号染色体上，有3个材料属于第二个转化事件，这些植株的侧翼序列与水稻基因组中不同染色体序列具有高度同源性，有6个样品属于第三个转化事件，为多拷贝植株，有3个样品属于第四个转化事件，为串联重复拷贝的植株，这些侧翼序列的获得为后期研究和评价转Cry1Ab基因水稻可能产生的非预期效应提供了必要的实验基础。转Cry1Ab基因抗虫水稻Bt01已申请进行环境释放试验，通过southern杂交实验，结果表明转Cry1Ab基因抗虫水稻Bt01为单拷贝植株。建立的转Cry1Ab基因抗虫水稻Bt01的转化体特异性定性、定量检测方法，经实验得出转化体特异性定性PCR检测体系的最低鉴定极限为10个拷贝，定量PCR检测体系的LOD为5个拷贝，LOQ为10个拷贝。结果表明：本研究建立的事件特异性定性与定量检测方法适用于转Cry1Ab基因抗虫水稻Bt01定性和定量检测，并且具有稳定性好、特异性强和灵敏度高的优点，该方法的建立补充和加强了转基因检测体系，同时也为其他转基因作物的检测提供参考。
【关键词】：
【学位授予单位】：沈阳师范大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：S511【目录】：
摘要4-5Abstract5-10第一章 绪论10-18 1.1 全球转基因作物的应用现状10-11 1.2 转基因植物的安全性评价及其方法11-14
1.2.1 转基因植物的安全性评价11-12
1.2.2 转基因植物侧翼序列获得的方法12-14 1.3 转基因作物检测方法14-16
1.3.1 蛋白质检测方法14-15
1.3.2 定性 PCR 检测方法15
1.3.3 荧光定量 PCR 方法15-16 1.4 本研究的目的和意义16-18第二章 转 Cry1Ab 基因水稻侧翼序列分子特征的研究18-31 2.1 试验材料18-19
2.1.1 植物材料18
2.1.2 试剂及仪器18-19 2.2 试验方法19-24
2.2.1 转基因水稻基因组 DNA 的提取19
2.2.2 转基因水稻内源基因 SPS 的检测19-20
2.2.3 转基因水稻外源基因的 PCR 检测20-21
2.2.4 转基因水稻侧翼序列的获得21-23
2.2.5 转基因水稻侧翼序列的分析与验证23-24 2.3 结果与分析24-29
2.3.1 转基因水稻内源基因 SPS 的扩增结果24-25
2.3.2 转基因水稻外源基因的 PCR 检测结果25
2.3.3 转基因水稻侧翼序列的获得结果与分析25-29 2.4 讨论29-31第三章 转化体特异性检测方法的建立31-48 3.1 试验材料31-33
3.1.1 植物材料31
3.1.2 试剂及仪器31-33 3.2 试验方法33-41
3.2.1 水稻基因组 DNA 的大量提取33
3.2.2 转基因水稻 Bt01 外源基因的 PCR 分子检测33-34
3.2.3 转基因水稻 Bt01 的 Southern 杂交34-37
3.2.4 水稻基因组 DNA 的提取37-38
3.2.5 转基因水稻 Bt01 侧翼序列的获得38
3.2.6 特异性定性 PCR 方法的建立38-39
3.2.7 特异性定量 PCR 检测方法的建立39-41 3.3 结果与分析41-47
3.3.1 水稻基因组 DNA 的提取及内源 SPS 基因的验证41-42
3.3.2 转基因水稻 Bt01 外源基因的 PCR 分子检测结果42
3.3.3 转基因水稻 Bt01 的 Southern 杂交结果42-43
3.3.4 转基因水稻 Bt01 侧翼序列的获得结果43-44
3.3.5 转化体特异性定性 PCR 检测结果44-45
3.3.6 转化体特异性定量 PCR 检测结果45-47 3.4 讨论47-48全文结论48-49参考文献49-53个人简历53-54致谢54
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【参考文献】
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